研究背景肝脏是人体最重要的脏器之一,担负着人体分泌胆汁、凝血、新陈代谢、吞噬或免疫作用、解毒、调节水与电解质等一系列复杂的生理功能。急性肝功能衰竭是以快速进展的严重肝功能损害引起严重肝功能不全疾病,严重危及人类生命。各种原因引起的急性肝功能衰竭,常规治疗病死率高达60-80%。目前临床上急性肝功能衰竭的有效治疗手段主要包括三种：原位肝移植、生物人工肝支持系统以及肝细胞移植。随着肝脏移植技术的发展及免疫抑制剂的使用,目前肝脏移植已经被认为是治疗各种终末期肝病及急性肝衰竭唯一有效的治疗手段。但因为肝器官移植受到供体器官短缺、手术风险大、治疗费用高、术后免疫排斥导致供肝功能丧失以及终生需要服用免疫抑制剂治疗等因素的限制,决定了其在我国广泛应用仍有一定的困难。以体外培养的肝细胞为核心构建的生物型人工肝支持系统是一种理想的替代治疗方法,但是因生物反应器价格昂贵、供肝细胞来源以及其治疗过程中可能产生的血流动力学紊乱等因素制约了其临床广泛应用。肝细胞移植具有技术简单,容易操作,对患者创伤小、费用相对低廉、肝细胞在体外培养后减少了细胞表面的抗原性,可以降低免疫排斥反应、移植肝细胞可以发挥肝脏解毒、合成功能等特殊优势。相关试验研究已证明肝细胞移植可延长急性肝衰竭患者供体等待时间,明显改善患者的肝功能水平,由于肝脏的再生能力和潜力很大,在接受肝细胞移植后,部分患者残存的肝脏得以再生,肝功能可以恢复至正常水平。因此,肝细胞移植已被认为是对终末期肝疾病及急性肝衰竭的一种具有良好发展前景的治疗方法。但是,它需要解决的问题仍有很多,主要包括细胞来源问题和高密度高活性肝细胞培养问题。肝细胞的质与量是肝细胞移植研究中的关键问题,如何方便地获取高密度、高质量、高活性的肝细胞已成为肝细胞移植成功需要解决的重要问题。以生物支架材料大孔微载体为核心的三维肝细胞培养有望解决此难题。主要利用微载体悬浮培养技术来实现肝细胞的高密度培养及扩增,使细胞在数量上及功能上都能达到临床应用的要求。利用微载体悬浮培养技术进行种子细胞的扩增和用来充当体内细胞治疗的传输载体,近年来在肝细胞移植、生物人工肝及组织工程领域的应用研究正日趋升温。相比于实心微载体,大孔微载体的明显优势在于为细胞生长、粘附、增殖提供了足够的空间和更大的面积,有利于营养物质的进入和代谢产物的排出,从而提高了细胞代谢活性和培养密度。然而,目前市售的微载体的主要成分多见于明胶、葡聚糖、纤维素等,缺乏肝细胞特异性,细胞生长较为缓慢,不容易黏附于微载体表面；而且随着培养时间的延长,细胞容易脱落、死亡,从而降低了细胞培养密度和活性。随着对组织工程支架材料的深入研究,研究人员发现对高分子材料进行适当的化学改性、表面修饰等处理,以增强其力学特性,生物相容性及肝特异性,可诱导和提高肝细胞在支架上的黏附和增殖行为。在肝组织工程支架方面,半乳糖基是肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor, ASGPR)的特异性配体,是肝细胞识别的相应位点并能产生特异性相互作用。以半乳糖基修饰各种天然原材料的和人工聚合物,通过聚合物链上的半乳糖基和肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体之间独特的分子识别功能,优化支架的肝细胞特异性,提高肝细胞的特异功能。在肝组织工程细胞外基质支架材料上接枝半乳糖基,可诱导和提高肝细胞在细胞外基质支架上的粘附和增殖行为。我们的前期研究工作中,以生物相容性良好的天然高分子材料丝素蛋白、壳聚糖、乳糖酸为原料,把半乳糖基引入壳聚糖中,应用乳化-化学交联将丝素蛋白与半乳糖基化壳聚糖复合,经过极性溶液处理、冷冻干燥等处理,制备出了一种肝细胞特异性丝素蛋白／半乳糖基化壳聚糖大孔微载体。成功建立了丝素蛋白／半乳糖基壳聚糖大孔微载体制备技术,扫描电子显微镜观察该大孔微载体表面及内部呈多孔结构,开口向外,呈喇叭状,孔的分布均匀,适合于肝细胞高密度培养。并通过1HNMR谱、FITR谱表征,证实半乳糖基已经成功接枝到支架材料之中。该支架材料中引入了肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的特异性配体一半乳糖基,成功制备出了一种具有肝细胞特异性的高性能的大孔微载体。体外丝素蛋白/乳糖基壳聚糖大孔微载体与肝细胞系C3A细胞悬浮培养实验表明肝细胞能与大孔微载体特异性黏附、细胞围绕微载体聚集生长,并表现出很好的活力。然而,体内环境相对于体外环境更为复杂,SF/GC大孔微载体C3A细胞复合物在体内能否有效存活?能否对动物急性肝衰竭模型进行有效的提高生存率、改善肝功能、减轻肝脏损伤?这些问题的深入探讨无疑将有助于细胞移植技术的发展。基于研究现状以及本课题组前期的工作结果,本实验拟采用丝素蛋白/乳糖基壳聚糖大孔微载体C3A细胞悬浮培养形成的复合物腹腔内移植的方法,以观察SF/GC大孔微载体C3A细胞复合物对急性肝功能衰竭的治疗效果。本研究旨在探讨SF/GC大孔微载体C3A细胞复合物在动物急性肝衰模型体内移植的可行性,为今后临床上更好的应用细胞移植技术治疗急性肝衰竭提供必要的理论和实验依据。目的以肝细胞系C3A细胞为移植细胞,以丝素蛋白/乳糖基化壳聚糖大孔微载体为载体,对C3A细胞行大孔微载体粘附培养、检测其生物学特性,探讨将丝素蛋白/乳糖基化壳聚糖大孔微载体粘附培养C3A细胞复合物植入到切除80%肝组织的急性肝功能衰竭大鼠模型腹腔内,观察存活率,检测肝功能水平及观察肝脏组织学变化,评价其对急性肝衰大鼠的治疗效果,为将来临床应用提供必要的理论和实验依据。方法首先采用冷冻干燥法制备丝素蛋白／半乳糖基壳聚糖大孔微载体,与肝细胞系C3A细胞进行粘附共培养,对其生物相容性及细胞功能进行检测,确定行大孔微载体C3A复合体移植的最佳时期。然后切除大鼠80%肝脏组织构建SD大鼠急性肝功能衰竭模型。最后大鼠肝衰模型建立后分别将培养72h的丝素蛋白／半乳糖基化壳聚糖大孔微载体C3A细胞复合物(A组)、C3A细胞悬液2mL(含6.0×107个C3A细胞,B组)植入到急性肝功能衰竭大鼠腹腔内。观察移植后大鼠1周内存活率,检测血清白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)肝功能指标,检查肝脏组织学变化。结果大孔微载体C3A细胞共培养第3天上清液中葡萄糖消耗及白蛋白浓度最高。丝素蛋白/乳糖基壳聚糖大孔微载体C3A细胞复合物对急性肝衰竭模型动物的实验显示,移植后1周急性肝衰竭大鼠的存活率分析比较：微载体组动物的生存率明显高于其他两组,A组为50%,B组为40%,C组为10%,各移植组高于对照组(P<0.05)。移植后1周内,微载体组肝功能各项指标水平逐渐下降,移植术后第7天肝功能各项指标逐渐接近正常水平,与移植第1日有显著统计学差异(P<0.05)。对照组肝功能各项指标水平无明显下降趋势,ALT水平于移植术后第1日达最高峰。肝组织切片形态学观察示大孔微载体C3A细胞复合物组移植第7天后肝脏病理有不同程度的恢复,较其他两组有明显改善。结论以丝素蛋白、壳聚糖、乳糖酸为原料制备的丝素蛋白/乳糖基化壳聚糖大孔微载体表面及内部为多孔结构,孔的分布均匀,具有肝细胞特异性,适合肝细胞高密度培养,是较为理想的细胞载体材料。大孔微载体与C3A细胞共培养能更好的维持培养的C3A细胞活性及功能,以第3天的功能较好,适合应用移植。通过切除大鼠80%肝脏组织能成功构建大鼠急性肝衰竭模型。丝素蛋白/乳糖基化壳聚糖大孔微载体具有良好的生物相容性,应用丝素蛋白/乳糖基化壳聚糖大孔微载体培养C3A细胞腹腔内移植治疗急性肝衰竭大鼠能提高生存率,改善肝功能,减轻肝脏病理改变。