蓝舌病(Bluetongue，BT)是热带和亚热带国家常见的一种感染反刍动物的虫媒传染病。该病由蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起，经媒介昆虫（库蠓）叮咬哺乳动物而传播，几乎可以感染所有的反刍动物，如山羊、绵羊、牛、鹿和骆驼等，其中绵羊最为易感，特别是羔羊。一般情况下，该病的致死率仅为20～30％，但是对于某些易感品种的绵羊，致死率可高达90％。因此，BT成为了制约动物和动物制品国际间贸易活动的阻碍之一，给畜牧业造成了严重的经济损失，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定上报类动物疫病。　　BTV属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus）的代表成员，其基因组为10个分节段的双股RNA(dsRNA)，分别编码7种结构蛋白(VP1～VP7)和4种非结构蛋白(NS1～NS4)。其中编码NS1蛋白的M5基因、编码NSS3/3a的S10基因，是10个节段dsRNA中相对保守的基因片段，而编码VP2蛋白的L2基因，是10个节段dsRNA中变异性最大的片段。由于BTV的RNA片段容易出现变异与漂移，使得RNA片段经过重排组合后可能形成新的BTV毒株。截止至2014年，全世界共鉴定有26个不同的血清型BTV，我国主要流行其中的7个血清型（BTV-1、2、3、4、12、15和16型），并且不同血清型之间缺乏交叉免疫保护，这就造成了疫苗免疫错综复杂。　　对于任何一种传染后的防控来说，快速而准确的病原诊断方法及有效的疫苗免疫手段都是最根本的策略。基于BTV血清型众多的特点，建立早期的检测与鉴别诊断方法，特别是针对每一个血清型病毒的快速的病原检测方法，对于进一步的防控至关重要。本研究通过网络数据库获取了不同血清型BTV的基因序列，并结合本实验室对现有BTV毒株基因序列测序的结果，分别利用One-step RT-PCR以及nested RT-PCR方法，建立了可以针对不同血清型BTV核酸都通用的群特异性核酸检测方法，同时通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验以及临床血液样品的检测，对BTV群特异性核酸检测方法进行评价和验证。结果显示，One-step RT-PCR检测方法对BTV-1～24血清型的病毒核酸均有良好的扩增，而对其他对照毒株的核酸无交叉反应;该方法能够有效的检测出≥100TCID50/mL的病毒核酸，并能够从感染BTV的羊的抗凝血样品中成功检测到BTV核酸。此外，本研究建立的nested RT-PCR检测方法，同样对BTV-1～24和BTV-26血清型的病毒核酸均有良好的扩增，并得到了与预期结果大小一致的PCR扩增产物，而对其他对照毒株的核酸无交叉反应。同时将BTV-16型病毒进行10倍倍比稀释，按照已建立的nested RT-PCR反应条件和体系进行敏感性试验。敏感性试验结果表明，该方法能够有效的检测出≥10TCID50/mL的病毒核酸，并能够从感染BTV的羊的抗凝血样品中成功检测到BTV核酸。　　本研究首次针对中国国内流行的七种血清型BTV病毒核酸，建立了型特异性的RT-PCR检测方法;同时也建立了22种不同血清型BTV的型特异性real-time RT-PCR检测方法。本研究以BTV基因组中变异性最大的L2基因为检测靶序列，并对本实验室保存的1～24血清型BTV的L2基因进行了测序，结合网络数据库中BTV各血清型的L2基因序列，对279条BTV的L2基因序列进行了同源性比对及进化分析，寻找到各个不同血清型BTV之间L2基因序列差异显著，而相同血清型BTV之间L2基因序列相对保守的区域作为鉴别BTV型特异性的RT-PCR引物结合位点以及real-time RT-PCR引物和TaqMan-MGB探针的结合位点，尤其是要保证TaqMan-MGB探针结合位点的保守性，设计并合成针对各种不同血清型BTV的型特异性检测引物和探针，并通过特异性试验、敏感性试验、模拟样品检测和重复性试验对BTV分型鉴别的RT-PCR检测方法进行评价和验证;同样通过特异性试验、敏感性试验、标准曲线的建立、样品检测和重复性试验对BTV分型鉴别的real-time RT-PCR检测方法进行评价和验证。特异性试验结果表明，RT-PCR及real-time RT-PCR分型鉴别检测方法均能够对其目标血清型的BTV核酸呈阳性扩增，而对其他血清型BTV核酸及亲缘关系较近的对照毒株核酸无交叉反应，具有良好的特异性;敏感性试验结果表明，各RT-PCR分型鉴别检测方法的敏感性分别为102～104个拷贝不等，而real-time RT-PCR分型检测方法的敏感性分别为10～102个拷贝不等，是普通RT-PCR方法的10倍以上。同时利用所构建的不同浓度的标准品对real-time RT-PCR各分型鉴别检测方法进行标准曲线的建立，试验结果表明，浓度为102～108个拷贝的标准品呈现出良好的线性关系。利用统计学方法对real-time RT-PCR分型检测方法所得到的扩增曲线的Cp值进行分析，所建立的各real-time RT-PCR分型检测方法Cp值的批内的变异系数(CV％)均在1以下，而Cp值的批间的CV％均在4以下,该结果表明所建立的各real-time RT-PCR分型检测方法均具有很好的重复性;同时对常规的RT-PCR分型检测方法进行了特异性、敏感性和样品检测的重复性试验，试验结果表明，各RT-PCR分型检测方法同样具有很好的重复性。本研究所建立的核酸检测方法，能够快速的对BTV核酸进行鉴别诊断，同时鉴定出病毒的血清型，使下一步的疫苗选择有的放矢，更具有针对性。　　本研究首次利用复制缺陷5型腺病毒载体表达BTV-16 VP2和VP5蛋白，由于此种病毒载体仅携带目的基因，而缺乏其他的亲本毒株的分子调控原件，所以大大降低了重组疫苗毒与野毒株之间发生基因重组的可能，从而提高了疫苗应用的安全性。但是之前的研究无法成功构建出重组腺病毒载体的BTV疫苗，原因可能是BTV基因序列中带有大量的大肠杆菌潜在的启动子序列，使得BTV基因在大肠杆菌中极不稳定，最终导致构建的失败。因此，本研究利用生物预测软件，找到BTV-16 VP2和VP5基因中潜在的大肠杆菌启动子序列，在不改变氨基酸序列的前提下，经过多轮的基因突变筛选，对BTV-16的VP2和VP5基因进行了优化，从而成功构建出了表达BTV-16 VP2和VP5基因的重组腺病毒，并对这两株重组腺病毒在模式动物小鼠及本体动物绵羊上进行免疫效果评价。　　重组腺病毒rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5对BALB/c小鼠免疫效果检测结果显示，经腹腔注射rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5的实验组小鼠在2免后1周，在其血清中均可检测到抗VP2或VP5的IgG和IgA抗体;而经滴鼻免疫rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5的实验组小鼠血清中，却检测不到抗VP2或VP5的IgG抗体，但是从第2次免疫后1周开始，可以检测到针对VP2或VP5的IgA抗体。与DMEM和rAd-△对照组相比，经腹腔注射或滴鼻免疫rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5的小鼠脾细胞都具有更强的刺激增殖效果;对各组脾细胞培养上清液中的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和IL-12细胞因子进行检测，检测结果显示，与DMEM和rAd-△对照组相比，腹腔注射rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5组的小鼠脾细胞上清中，IFN-γ、IL-2和IL-12显著增高，IL-4略有升高，IL-10无显著变化;滴鼻免疫rAd-VP2和rAd-VP2-1RES-VP5组的小鼠脾细胞上清中IFN-γ和IL-2显著增高、而IL-4、IL-10和IL-12的含量均无明显变化;该结果说明了本研究对小鼠的免疫，刺激了小鼠Th1类细胞的免疫应答。体外和体内中和试验结果表明，腹腔注射和滴鼻免疫重组腺病毒rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5组的小鼠血清对BTV-16具有明显的中和保护作用。　　重组腺病毒rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5对绵羊免疫效果检测结果显示，免疫rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5的实验组绵羊血清中，从第2次免疫后1周开始检测到抗VP2或VP5的IgG和IgA抗体。与DMEM和rAd-△对照组相比，免疫rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5的绵羊外周血淋巴细胞都具有更强的刺激增殖效果;且血清中IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12的含量均有所升高，而IL-4和IL-10无显著变化;该结果表明，本研究对绵羊的免疫，刺激其Th1类细胞发生免疫应答。体外和体内中和试验结果表明，免疫重组腺病毒rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5组的绵羊血清对BTV-16具有明显的中和保护作用。　　本研究成功建立了适用于不同血淆型BTV的One-step RT-PCR及nested RT-PCR群特异性核酸检测方法、成功建立了针对中国流行的七种血清型BTV(BTV-1、2、3、4、12、15和16型)的RT-PCR分型鉴别检测方法以及首次在我国成功的建立了BTV-1～19、22～24型病毒核酸的real-time RT-PCR分型鉴别检测方法。这些方法为我国对BTV的早期诊断和流行病学监测提供了有利的技术手段，也为对BT的疫苗免疫提供了理论依据;同时，本研究成功构建了BTV-16的复制缺陷5型重组腺病毒rAd-VP2和rAd-VP2-IRES-VP5，此两种重组腺病毒可以有效的诱导小鼠和绵羊的体液免疫和细胞免疫应答，从而为BT的综合防控奠定了基础。