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近10多年来,心脑血管疾病成为威胁人类健康和生命的“头号杀手”,在发达国家占第一位死亡原因,而一些发展中国家发病率和死亡率也在呈上升趋势。全世界每死亡3个人,就有1个人是死于心脑血管疾病。大量医学资料显示,造成心脑疾病的最主要原因与心脏和大脑的L型钙通道的功能紊乱密切相关,L型钙通道的钙内流广泛调节组织和细胞的各种生理功能,如肌肉收缩、神经递质释放、激素分泌、突触的可塑性、基因表达、生物膜的通透性及细胞兴奋性的控制等方面。无论是在心脏还是大脑的L型钙通道,Cavl.2蛋白都是大分子蛋白混合物中最主要的一员,这个混合物还包括β2肾上腺素受体、三聚体Gs蛋白、腺苷酸环化酶AC和依赖cAMP信号的蛋白激酶PKA等成分。Cav1.2蛋白的功能改变提示心血管和神经疾病的发生,如动脉纤维化、心衰和大脑缺血时神经细胞死亡等。由于L型钙通道对于细胞功能起到颇为重要的作用,因此相当多的信号因子广泛调节着此通路。细胞外β肾上腺素能信号导致细胞内第二信使cAMP浓度增加,激活蛋白激酶PKA,磷酸化底物蛋白,这是经典的β-cAMP-PKA信号转导系统,是完成细胞生理功能的基本途径。因为蛋白激酶和蛋白磷酸酶使蛋白发生磷酸化和去磷酸化几乎涉及到所有的生理过程。所以,对于任何特定的信号系统,去磷酸化的磷酸酶一定精确的控制着这一通路,用以维持一定水平的磷酸化。磷酸酶PP2A可能是通过对Cav1.2蛋白去磷酸化作用来有效的平衡因PKA或其他激酶引起的钙通道蛋白的磷酸化来负性调节着L型钙通道电流。过去的研究已经确定：通过刺激β2肾上腺素受体而激活cAMP-PKA信号通路,可明显增加钙通道电流。PP2A能够逆转对cAMP-PKA信号通路对钙通道Cav1.2功能的增强作用,PP2B基于实验状况的不同增强或减弱心肌细胞钙通道Cav1.2的电流。目前已证实磷脂酶PP2A和PP2B结合在Cav1.2蛋白C末端相同的一段区域。然而,PP2A和PP2B到底在空间上怎样结合到Cav1.2蛋白,以及这种结合所产生的功能影响一直困扰着我们。所以,本论文主要是从分子水平详细探讨磷酸酶PP2A和PP2B与L型钙通道蛋白Cav1.2的精确结合区域以及磷酸酶对钙通道蛋白Cav1.2的功能调节作用。本研究首先制备纯化蛋白,通过采用多肽芯片实验、外源GST-Pulldown实验和内源免疫沉淀实验确定蛋白和蛋白相互作用的结合位点,并通过电生理分析及多肽对PP2A和PP2B的活性影响分析实验来检测Cav1.2蛋白和磷酸酶PP2A/PP2B在电生理活动中的变化,来阐述PP2A和PP2B靶向Cav1.2蛋白C末端的分子机制,具体实验共分以下几个部分：第一部分,制备纯化蛋白,将兔心脏α1 1.2残基1909-2029作为模板构建重组质粒载体：GST-CT-8, GST-CT-8-1, GST-CT-8-2, GST-CT-8-3, GST-CT-8-4, GST-CT-8-P[14],及GST-CT-B[15],然后进行转化、提纯、酶切、测序鉴定。将上述所有质粒及6-His-PP2A/C[16]和PP2B的重组表达质粒在Nova Blue和BL21 Star的大肠杆菌里表达并纯化为融合蛋白第二部分,首先通过将跨越兔心脏α1 1.2残基1784-2067的氨基酸按序列漂移原则合成在一张PVDF膜上。每一个由15个氨基酸组成的点从前往后依次推进一个氨基酸,阻断PVDF膜,并与PP2A/C的纯化蛋白孵育,洗涤后用PP2A/C抗体做多肽芯片的Immunoblot分析。然后使用纯化的蛋白PP2A、PP2B及CT-8各片段的GST融合蛋白,及各种多肽进行Pulldown相互作用研究。最后利用鼠心脏和大脑与冰浴溶液制成匀浆与抗a1 1.2抗体或对照IgG抗体,Protein-A Sepharose及Pep1,4,5孵育,采用免疫共沉淀方法来检测内源Cav1.2-PP2A/PP2B混合物与多肽的竞争结合。第三部分,取新制备的成年兔心肌细胞,用β-escin[20]建立全细胞穿孔膜片钳,在室温中记录L型钙电流。并将包含pepl、pep4和pep5或没有多肽的β-escin水溶液后加注到电极液中进行电生理分析来检测电流密度变化。并使用DuoSet IC (R+D Systems) malachite green/molybdate-based PP2A activity assay对PP2A活性进行评估,使用malachite green/molybdate-based Calcineurin Assay Kit对PP2B活性进行评估,来观察是否可排除Pep1,4,5对磷酸酶本身活性的影响。综上所述,通过以上实验可以得出以下结论：1.PP2A结合L型钙通道Cav1.2蛋白中间孔道区域的α亚单位C末端：一个区域跨越残基1795-1818,另一个跨越残基1965-1971 (1965LSPLLQR1971)。PP2B结合在1971的下游(1971RSHSPTSLPR1980)。2.包含残基1965-1971的一个合成多肽(LSPLLQRSHSPTSLPRPCATPP)能够取代内源Cav1.2蛋白与PP2A的结合,不能够取代内源Cav1.2蛋白与PP2B的结合。3.此多肽(LSPLLQRSHSPTSLPRPCATPP)明显增加了急性分离的心肌细胞在基础状态下和异丙肾上腺素刺激状态下的L型钙通道的电流。4.心脏和大脑的磷酸酶PP2A可能是通过对抗PKA或其他激酶引起的磷酸化来负性调节着L型钙通道的电流。