【背景与目的】鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是导致肠道感染的重要人畜共患病原菌,是一种革兰氏阴性杆菌。鼠伤寒沙门氏菌主要通过污染的食物或水经粪口传播,经胃入肠后,在肠道内增殖,粘附于肠黏膜上皮细胞,进而侵入固有层,引起的症状轻至肠炎重至败血症和全身系统性播散引起的内脏损害。然而,鼠伤寒沙门氏菌在宿主体内播散的分子机制尚待进一步确定。有研究表明HIV的播散机制是通过与人抗原提呈细胞上表达的C型凝集素受体DC-SIGN(CD209a)相结合,从而劫持抗原提呈细胞促进病毒的播散。我们前期的研究发现,敲除脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)O抗原表达基因的鼠伤寒沙门氏菌突变株,暴露出核心寡糖后也可以与DC-SIGN(CD209a)相结合。但野生型的鼠伤寒沙门氏菌O抗原覆盖了其核心脂多糖。在本研究中,我们通过被巨噬细胞吞噬后失去O抗原的鼠伤寒沙门氏菌与CD209的相互结合侵袭抗原提呈细胞,以及观察鼠伤寒沙门氏菌播散至小鼠的局部淋巴结、脾脏、肝脏的情况,进而证明鼠伤寒沙门氏菌能像HIV一样,可以通过与CD209的相结合,利用抗原提呈细播散至淋巴结、脾脏和肝脏,从而引起宿主感染。【方法】1.体外实验检测经巨噬细胞RAW264.7吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白Pgt E的纤维蛋白溶酶原激活功能用小鼠巨噬细胞样细胞系RAW264.7吞噬鼠伤寒沙门氏菌后裂解得到释放的鼠伤寒沙门氏菌LT2(ST-treated),通过纤维蛋白溶酶原激活物活性比色法检测ST-treated和未被处理过的鼠伤寒沙门氏菌LT2(ST)的Pgt E对纤维蛋白溶酶原的活化作用。2.体外实验检测经巨噬细胞吞噬后释放的和未处理过的鼠伤寒沙门氏菌对人和鼠的抗原提呈细胞的侵袭能力1)纯化人肠道组织中的树突状细胞,用ST-treated和ST侵袭人肠道树突状细胞,表达和不表达O抗原的大肠杆菌作为对照,通过庆大霉素保护法检测侵袭能力。2)将表达绿色荧光蛋白的质粒p Ac GFP1转入鼠伤寒沙门氏菌,用ST-treated和ST侵袭小鼠腹腔巨噬细胞,表达和不表达O抗原的大肠杆菌作为对照,通过庆大霉素保护实验和流式细胞术检测侵袭能力。3.体外实验检测经巨噬细胞吞噬后释放的和未处理过的鼠伤寒沙门氏菌对CHO、CHO-m SIGNR1以及CHO-h DC-SIGN的侵袭能力用ST-treated和ST侵袭CHO、CHO-m SIGNR1以及CHO-h DC-SIGN稳转细胞,26℃孵育的假结核耶尔森菌、表达和不表达O抗原的大肠杆菌作为对照,通过庆大霉素保护法检测侵袭能力。4.细胞侵袭抑制实验用甘露寡糖与CHO-m SINR1和CHO-h DC-SIGN稳转细胞孵育,加入ST-treated,以26℃孵育的假结核耶尔森菌和不表达O抗原的大肠杆菌作为对照,通过庆大霉素保护法检测侵袭能力。5.动物体内感染实验检测细菌在体内的播散将质粒p BR322和表达O抗原的质粒p AY100.1转入鼠伤寒沙门氏菌,通过灌胃途径感染C57BL/6J小鼠,4天后取小鼠脏器研磨,观察细菌在小鼠体内播散情况。6.动物体内感染实验检测小鼠生存率1)通过灌胃途径,用携带p BR322的鼠伤寒沙门氏菌(ST-p BR322)和携带p AY100.1的鼠伤寒沙门氏菌(ST-p AY100.1),观察小鼠存活率。2)ST-p BR322灌胃感染给予甘露寡糖或未给予甘露寡糖的C57BL/6J小鼠,观察细菌对小鼠存活率的影响。3)通过腹腔注射途径,用ST-p BR322和ST-p AY100.1感染C57BL/6J小鼠,观察细菌对小鼠存活率的影响。【结果】1.经巨噬细胞系RAW264.7吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌会暴露其核心寡糖鼠伤寒沙门氏菌拥有外膜蛋白PgtE,然而其激活纤维蛋白溶酶原的功能受到O抗原的抑制。鼠伤寒沙门氏菌经过巨噬细胞系RAW264.7处理后,Pgt E具有激活纤维蛋白溶酶原的活性。p AY100.1在鼠伤寒沙门氏菌中可以稳定表达O抗原,转入质粒p AY100.1的鼠伤寒沙门氏菌无论是否经巨噬细胞吞噬后释放,Pgt E活性均较低,说明巨噬细胞吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌会暴露其核心寡糖。2.经巨噬细胞吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌具有更强的侵袭人和小鼠的抗原提呈细胞的能力经过巨噬细胞吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌暴露核心寡糖后,我们检测它和抗原提呈细胞之间的相互作用。实验表明,ST-treated比ST对小鼠原代腹腔巨噬细胞和人肠道固有层树突状细胞的侵袭能力更强。说明经巨噬细胞吞噬后,暴露核心寡糖的鼠伤寒沙门氏菌侵袭人和小鼠抗原提呈细胞的能力更强。3.人的DC-SIGN(h DC-SIGN)和小鼠的SIGN-R1(m SIGN-R1)是巨噬细胞吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌的受体用ST-treated和ST侵袭表达h DC-SIGN(h CD209a)的稳转细胞(CHO-h DC-SIGN)和表达m SIGN-R1(m CD209b)的稳转细胞(CHO-m SIGN-R1)以及不表达受体的CHO细胞,沙门氏菌对表达受体的CHO侵袭力更强,而ST-treated比ST对CHO-h DCSIGN和CHO-m SIGN-R1侵袭能力强,说明人的h DC-SIGN和小鼠的m SIGN-R1是巨噬细胞处理后的鼠伤寒沙门氏菌侵袭人和小鼠抗原提呈细胞的受体。4.CD209介导的鼠伤寒沙门氏菌对细胞的侵袭会被甘露寡糖所抑制加入甘露寡糖后,巨噬细胞吞噬后释放的鼠伤寒沙门氏菌对CHO-h DC-SIGN的侵袭力显著降低,而对CHO-m SIGNR1的侵袭途径影响不显著,说明甘露寡糖可以抑制CHO-h DC-SIGN与巨噬细胞处理过的鼠伤寒沙门氏菌之间的相互结合,且h DCSIGN(h CD209a)和m SIGN-R1(m CD209b)在和鼠伤寒沙门氏菌的相互作用中有所区别。5.稳定表达的O抗原抑制鼠伤寒沙门氏菌在小鼠体内的播散用稳定表达O抗原的鼠伤寒沙门氏菌ST-p AY100.1和只携带空载质粒的鼠伤寒沙门氏菌ST-p BR322通过灌胃途径感染小鼠后,对小鼠脏器内的细菌数目进行计数,ST-p AY100.1组小鼠脏器的菌量明显低于ST-p BR322组,表明稳定表达的O抗原会抑制鼠伤寒沙门氏菌在小鼠体内的播散。6.稳定表达的O抗原和甘露寡糖均能降低鼠伤寒沙门氏菌的感染能力感染ST-p AY100.1的小鼠存活率明显高于感染ST-p BR322的小鼠,用ST-p BR322感染给予或未给予甘露寡糖的小鼠后,给予甘露寡糖的小鼠存活率显著高于未给予甘露糖的小鼠。说明O抗原的表达和甘露寡糖均能降低鼠伤寒沙门氏菌的感染力。【结论】本研究证明鼠伤寒沙门氏菌侵入宿主后暴露核心寡糖,通过结合CD209来劫持抗原提呈细胞从而促进其在宿主体内的播散。【背景与目的】鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis,简称鼠疫菌)可以引起典型的自然疫源性烈性传染病鼠疫(Plague),根据传播途径不同,可引起腺鼠疫、肺鼠疫和败血症鼠疫。鼠疫菌是由肠道病原菌假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)进化而来,假结核耶尔森氏菌引起的只是温和的肠道自限性腹泻,而在进化过程中获得质粒p PCP1和质粒p MT是假结核耶尔森氏菌进化为致死性鼠疫菌的重要环节。p PCP1可以编码三种蛋白,其中的pla基因编码外膜蛋白纤维蛋白溶酶原激活物(plasminogen activator,Pla)是目前为止鼠疫菌感染中唯一的毒力因子,并且在进化过程中鼠疫菌获得pla后才具有引起肺鼠疫的能力。Pla可以裂解纤溶酶、α2-抗纤溶酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1等,降解补体C3成分。我们前期的实验研究发现Pla可以利用宿主细胞表面的C型凝集素受体m DEC205(CD205)介导细菌的侵袭和播散。研究发现尽管Pla并非为败血症鼠疫所必须,但是在腺鼠疫中Pla可以激活宿主纤维蛋白溶解系统,从而促进鼠疫菌的播散。在肺鼠疫中,Pla对细菌在肺部的大量繁殖起到重要作用。因此,Pla是腺鼠疫和肺鼠疫感染中重要的毒力因子。而pla在鼠疫菌进化过程中的来源仍然不明确。Pla和肠道病原菌鼠伤寒沙门氏菌的毒力因子Pgt E同属于外膜蛋白家族,它们有各自的降解底物,但功能上有非常高的相似性,O抗原的缺失都加强其纤溶酶原激活作用和侵袭力。不仅如此,根据pla和pgtE的基因测序以及Pla和Pgt E的氨基酸序列分析,Pla和Pgt E的编码基因同源性达69%,蛋白质同源性达75%。结合对于pla与pgtE基因序列和编码蛋白氨基酸序列的研究,我们推测肠道致病菌假结核耶尔森氏菌在进化为鼠疫菌的过程中获得的pla可能与同为肠道病原菌鼠伤寒沙门氏菌的pgtE有关。本研究拟通过将鼠伤寒沙门氏菌pgtE转入鼠疫菌后,检测其激酶活性和与CD205结合后促进侵袭的能力,对宿主抗原提呈细胞的侵袭能力,模拟肺鼠疫感染途径观察重组鼠疫菌对小鼠的致病力,从而探讨是否鼠伤寒沙门氏菌的pgtE与鼠疫菌的pla相似,其编码蛋白能通过结合CD205来促进鼠疫菌的感染,为两者的关系提供新的证据。【方法】1.检测表达Pgt E的鼠疫菌纤溶酶原激活物活性将表达Pgt E和Pla的质粒分别转入鼠疫菌和大肠杆菌中,用纤维蛋白溶酶原激活物活性比色法检测Pgt E和Pla在鼠疫菌中的活性。2.检测表达Pgt E的大肠杆菌和鼠疫菌对肺泡巨噬细胞的侵袭能力用庆大霉素保护法检测E.coli-pla(表达Pla的大肠杆菌)、E.coli-pgtE(表达Pgt E的大肠杆菌)、1419-pla(表达Pla不表达Pgt E的鼠疫菌)、1419-pgtE(表达Pgt E不表达Pla的鼠疫菌)对小鼠肺泡巨噬细胞的侵袭能力,1419和1418为对照组。3.检测表达Pgt E的大肠杆菌和鼠疫菌对CHO-m DEC205稳转细胞的侵袭用庆大霉素保护法检测E.coli-pla、E.coli-pgtE、1419-pla、1419-pgtE对稳转细胞CHO-m DEC205的侵袭能力。表达O抗原的假结核耶尔森氏菌Y1、大肠杆菌DH5α、DH5α-pla(表达Pla)作为对照组。4.动物感染体内实验1)用转入表达质粒p SE380的野生型鼠疫菌91001p SE380、91001p PCP1--p SE380(敲除质粒p PCP1后转入p SE380的鼠疫菌)、91001p PCP1--pla(转入pla的91001p PCP1-)、91001p PCP1--pgtE(转入pgtE的91001p PCP1-)通过鼻内途径感染小鼠,模拟肺鼠疫途径,48小时后处死取组织器官,HE染色检测小鼠肺部炎症细胞浸润情况。2)用野生型鼠疫菌91001p SE380、91001p PCP1--p SE380、91001p PCP1--pla(转入pla的91001p PCP1-)、91001p PCP1--pgtE(转入pgtE的91001p PCP1-)通过鼻内途径感染小鼠,模拟肺鼠疫途径,观察小鼠的存活率。【结果】1.Pgt E在重组的鼠疫菌中仍具有激活纤维蛋白溶酶原的活性将表达Pgt E和Pla的质粒分别转入鼠疫菌和大肠杆菌后,用纤维蛋白溶酶原激活物活性比色法检测,重新转入pla的1419(鼠疫菌1418敲除p PCP1)和E.coli-pla纤维蛋白溶解酶原活化活性与未敲除p PCP1的1418接近,转入pgtE的1419活化作用虽然较慢,但与1419比较活性显著增加,说明Pgt E在鼠疫菌可以表达且其活性并未受到抑制。2.Pgt E介导重组大肠杆菌和鼠疫菌对小鼠肺泡巨噬细胞的侵袭取小鼠肺泡巨噬细胞,将pla和pgtE转入鼠疫菌和大肠杆菌后,用庆大霉素保护法检测发现E.coli-pgtE侵袭小鼠肺泡巨噬细胞的能力比E.coli显著增高,1419-pla、1419-pgtE侵袭肺泡巨噬细胞的能力显著高于1419。表明Pgt E同Pla一样可以介导重组大肠杆菌和鼠疫菌对小鼠肺泡巨噬细胞的侵袭。3.m DEC205是表达Pgt E的细菌侵袭细胞的受体E.coli-pgtE对表达小鼠DEC205的CHO细胞有较强的侵袭力,1419-pla、1419-pgtE对稳转细胞CHO-m DEC205的侵袭能力比1419显著增加。说明在细菌和细胞相互作用的过程中,m DEC205是表达Pgt E的细菌侵袭细胞的受体。4.Pgt E的表达促进鼠疫菌加剧小鼠肺部炎症细胞浸润91001p PCP1--pla、91001p PCP1--pgtE通过鼻内途径感染小鼠后,HE染色结果显示小鼠肺部炎症细胞浸润数量显著多于91001p PCP1--p SE380,说明Pgt E在鼠疫菌中和Pla一样促进鼠疫菌对小鼠肺部的炎症损伤。5.Pgt E的表达降低p PCP1敲除的鼠疫菌感染小鼠的生存率91001p PCP1--pla、91001p PCP1--pgtE通过鼻内途径感染小鼠后,小鼠的存活率显著低于91001p PCP1--p SE380感染的小鼠,说明Pgt E的表达增强了p PCP1质粒缺失鼠疫菌的致死率。【结论】本研究证明了Pgt E和Pla一样可以利用m DEC205侵袭宿主抗原提呈细胞,并促进鼠疫菌在宿主内的感染,引起肺部损伤,为鼠伤寒沙门氏菌的pgtE与鼠疫菌的pla之间的关系提供了新的证据。