肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导喉鳞状细胞癌凋亡的实验研究实验目的喉鳞状细胞癌(LSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率有明显增长的趋势，易发生淋巴结转移，预后较差，严重威胁着人类的健康。目前临床上对于LSCC的诊断和治疗多采用联合应用手术、放疗和化疗等方法。虽然随着诊断和治疗技术的不断提高，治疗后的生存时间以及喉功能的保留都有明显提高，但对于晚期及复发患者的治疗效果仍不尽如人意。并且，喉鳞癌对大部分化疗药物不敏感，应用化疗药物常常达不到明显的治疗效果，还存在着一定的毒副作用，给治疗带来了困难。因此早期发现、早期治疗、寻找新的有效的治疗药物以及减少对正常组织的损害成为迫切需要解决的问题。近年来从研究基因改变和凋亡信号传导异常的肿瘤发生机制入手，发现通过一系列细胞因子介导的肿瘤细胞凋亡可杀灭多种肿瘤细胞，为恶性肿瘤的治疗提供了一个新的方向。凋亡(apoptosis)是细胞自身维持体内环境稳态平衡的一种程序化死亡机制，在清除肿瘤细胞、自身反应性淋巴细胞和病毒感染细胞维持机体正常生理功能中起重要作用。现代肿瘤学证明，恶性肿瘤的发生、发展是一个多因素、多阶段、多基因作用的结果，细胞凋亡在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用，很多基因参与了这一过程，并发挥了各自不同的作用。细胞增殖和凋亡的失衡将导致肿瘤的发生并影响肿瘤的生物学行为。肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(Tumor necrosis factor related apoptosis induceligand，TRAIL)是新近发现的TNF家族新成员，它与TNF-α和Fasl一样作为凋亡细胞外活化因子与特异的受体结合而发挥作用，与前两者比较，其诱导肿瘤细胞凋亡的能力更强而没有明显的细胞毒性，抗癌谱广，即使是全身用药，也不会象TNF-α那样产生严重的炎症反应。因此，TRAIL被认为是很有潜力且有效的抗肿瘤因子，已用于恶性肿瘤治疗的研究。目前对于TRAIL抑制肿瘤的实验已经取得了一定的成绩。发现其能有效的抑制人肝癌、乳腺癌、肾癌、鼻咽癌、食管癌等肿瘤在动物体内的生长。但TRAIL在喉鳞癌中的研究尚未见报道。TRAIL及其受体在喉鳞状细胞癌中的表达分布情况、其抑制喉鳞状细胞癌的效果如何，仍有待于进一步探讨。为了进一步研究其对喉鳞状细胞癌的作用机制，我们通过逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法以及免疫组织化学方法，检测了68例LSCC和30例正常喉黏膜中TRAIL及其死亡受体DR4、DR5，诱骗受体DcR1、DcR2的表达及分布情况；其后，应用不同浓度TRAIL作用于体外培养的喉鳞癌Hep-2细胞，通过倒置显微镜及透射电镜观察细胞的微观形态学改变，应用噻唑蓝染色(MTT)、流式细胞仪、原位末端标记(TUNEL)等方法，分析TRAIL对Hep-2细胞凋亡诱导作用的机制；并且建立人喉鳞癌裸鼠动物模型，应用TRAIL进行治疗，观察其在动物体内抑瘤效果，应用苏木精-伊红(H-E)染色及透射电镜进行肿瘤微观形态学观察，研究TRAIL抑制喉鳞癌的机制。材料和方法1、选取中国医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科及哈尔滨医科大学附属第二医院耳鼻咽喉-头颈外科2005年3-6月期间手术切除的68例喉鳞癌标本，应用RT-PCR及免疫组化方法检测TRAIL及其受体DR4、DR5、DcR1、DcR2的表达情况，取同期手术切除的30例正常喉粘膜作为对照。2、分别将不同浓度的TRAIL加入到体外培养的喉鳞癌Hep-2细胞中，应用倒置显微镜，透射电镜观察经TRAIL作用后细胞的微观形态学改变，应用MTT法绘制细胞的生长曲线，观察细胞生长抑制率。应用流式细胞仪及TUNEL检测细胞凋亡发生率。3、应用Hep-2细胞株建立人喉鳞癌裸鼠动物模型并应用TRAIL进行治疗，观察肿瘤的生长情况，裸鼠的生存状态，以及死亡发生的情况。并分别在光学显微镜，透射电镜下对两组的肿瘤组织进行微观形态学观察。结果1、经RT-PCR及免疫组化检测发现，在LSCC及正常喉黏膜组织中普遍存在着TRAIL及其受体的表达，并且存在着表达类型的差异。其中，TRAIL及诱骗受体DcR1、DcR2在LSCC中表达较低，而在正常喉黏膜中则表达较高，差异具有统计学意义(P均＜0.01)。死亡受体DR4、DR5在LSCC及正常喉黏膜中的表达无明显差异(P均＞0.05)。2、RT-PCR结果显示，在早期喉癌(Ⅰ+Ⅱ期)，其表达TRAIL及诱骗受体DcR较高，而晚期喉癌(Ⅲ+Ⅳ)中则表达较低，差异具有统计学意义(P均＜0.05)，死亡受体DR在两组间无明显差异(P均＞0.05)；TRAIL及DcR在分化程度高的肿瘤组中表达也高，在分化程度中、低组的肿瘤表达低，差异具有统计学意义(P均＜0.01)，死亡受体DR在两组间无明显差异(P均＞0.05)。3、免疫组化分析发现，在早期喉癌(Ⅰ+Ⅱ期)，其表达TRAIL及诱骗受体DcR较高，而在晚期喉癌(Ⅲ+Ⅳ)中则表达较低，差异具有统计学意义(TRAILP＜0.05，DcR P＜0.01)，死亡受体DR在两组间无明显差异(P均＞0.05)；TRAIL及DcR在分化程度高的肿瘤组中表达高，在分化程度中、低组的肿瘤表达低，差异具有统计学意义(TRAIL P＜0.05，DcR1 P＜0.01，DcR2 P＜0.05)，死亡受体DR在两组间无明显差异(P均＞0.05)。4、通过倒置显微镜观察发现TRAIL对Hep-2细胞的作用与药物的剂量存在着明显相关系，TRAIL的浓度越高，其对细胞生长的抑制作用也越显著。5、电镜观察发现，应用TRAIL处理后的Hep-2细胞中可见细胞发生凋亡，细胞内出现核碎裂，核仁消失，染色质固缩，电子密度增高，线粒体肿胀，嵴不清，并观察到有凋亡小体形成。6、MTT证实不同浓度的TRAIL作用于体外培养的喉癌Hep-2细胞24小时，其细胞生长抑制率随着浓度的增加逐渐增大，而流式细胞仪分析，当TRAIL浓度为(1，10，100ng／ml)时，诱导凋亡率分别为11.49±0.36％，22.31±0.82％，59.64±1.10％，与对照组(TRAIL浓度0ng／ml)凋亡率3.13±0.12％之间比较，差异均具有统计学意义(P均＜0.01)。7、TUNEL检测经TRAIL作用后的所有标本都能观察到细胞核染成棕黄色的凋亡细胞。喉鳞癌Hep-2细胞经TRAIL(1，10，100ng／ml)处理后凋亡率分别为16.66±0.80％，42.01±2.58％，68.93±2.12％，与对照组(TRAIL浓度0ng／ml)凋亡率为3.32±0.19％之间比较差异均具有统计学意义(P均＜0.01)。8、喉鳞癌裸鼠动物模型均建立成功。实验发现，注射TRAIL(100ng／ml)治疗的实验组裸鼠状态良好，无明显消瘦，瘤体生长缓慢、停滞，而应用PBS的对照组肿瘤持续增长，体积明显增大，呈多中心生长，裸鼠状态差，渐消瘦，呈现恶液质状态，甚至死亡；观察期间内，对照组裸鼠死亡8只，死亡率为40％，而应用TRAIL的实验组，裸鼠仅死亡1只，死亡率为5％。治疗后两组裸鼠肿瘤体积、肿瘤重量相比较，实验组肿瘤明显小于对照组，差异具有统计学意义(P均＜0.01)，抑瘤率为53.8％。9、H-E染色光镜观察可见，对照组肿瘤细胞生长旺盛，细胞分裂相多见，萎缩坏死区较少；而TRAIL治疗组肿瘤生长受抑制，分裂不明显，出现多处萎缩坏死灶。10、电镜观察实验组肿瘤细胞生长受到抑制，核内染色质电子密度增高，胞质内膜结构减少，线粒体电子密度增大，嵴不清，核固缩，有凋亡小体形成。而对照组肿瘤细胞生长分裂旺盛，细胞间连接呈融合状态，胞质内线粒体嵴清晰，游离核蛋白体丰富，核膜结构完好。结论1、在LSCC及正常喉黏膜组织中，均存在TRAIL及其四个受体的表达，TRAIL及诱骗受体DcR在LSCC组织中与在正常喉黏膜中表达存在差异，这种分布特征是TRAIL对不同细胞表现出的选择性杀伤作用的基础。2、在LSCC组织中，TRAIL与死亡受体结合而发挥作用，诱导喉鳞癌肿瘤细胞发生凋亡，而在正常喉黏膜组织中诱骗受体可以竞争死亡受体与TRAIL结合从而抑制凋亡。3、TRAIL及诱骗受体DcR的表达分布与LSCC的病理分期以及分化程度均存在明显的相关性。4、人喉鳞癌Hep-2细胞对TRAIL的作用敏感，在体外TRAIL对Hep-2细胞的生长存在着抑制作用。其作用机制是通过诱导细胞发生凋亡来实现的。5、TRAIL诱导喉鳞癌Hep-2细胞凋亡的作用具有剂量的依赖性，增大用药剂量可使其作用增强。6、TRAIL可以通过诱导喉鳞癌肿瘤细胞凋亡从而抑制人喉鳞癌肿瘤在动物体内的生长。