拟态弧菌(Vibrio mimicus)是一种革兰氏阴性细菌,可以感染包括草鱼(Ctenopharyngodon idella)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、南方鲇(Silurus meridionalis)和锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)在内的多种经济鱼类,拟态弧菌除了会引起水生动物腹水病,还可以感染人类并引起腹泻、恶心、呕吐、腹痛和发烧。病原菌感染动物主要是依赖于其毒力因子,在拟态弧菌中也鉴定出了一些毒力因子,例如溶血素、肠毒素、外膜蛋白、菌毛和鞭毛等。由拟态弧菌感染引起的高死亡率导致鱼类养殖业重大的经济损失,并成为制约水产养殖业发展的瓶颈,因此迫切需要开发针对这种病原菌的疫苗。外膜蛋白U(Outer membrane protein U,OmpU)是多种致病性弧菌中的一种保守的外膜蛋白,也是疫苗开发的重要保护性抗原。本研究以黄颡鱼拟态弧菌OmpU基因为研究对象,将原核表达纯化的带有His标签的拟态弧菌OmpU(His-OmpU)用作亚单位疫苗,福尔马林灭活的拟态弧菌灭活疫苗、纯化的His标签蛋白(His-tag)和PBS作为对照,对它的免疫保护作用进行探究。为了构建OmpU原核表达质粒,首先根据Gen Bank中发布的草鱼拟态弧菌OmpU基因序列(登录号KC182593.1)设计的引物对OmpU基因进行PCR扩增,然后将OmpU基因插入p ET-32a(+)载体的Bam H(40)和Xho(40)位点。将构建的质粒p ET-OmpU转化至大肠杆菌DH5a,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3),通过在16°C下用0.5 m M IPTG诱导12 h来表达重组融合蛋白His-OmpU,最后用Ni-NTA柱对重组蛋白His-OmpU进行纯化,并通过考马斯亮蓝染色和Western blot检测分析。结果显示:通过PCR扩增得到黄颡鱼拟态弧菌OmpU全长基因并进行测序,拟弧菌的OmpU基因编码一个343个氨基酸的蛋白质。序列比对结果表明:黄颡鱼拟态弧菌OmpU和草鱼拟态弧菌OmpU之间核苷酸和氨基酸序列相似性分别为90.27%和93.62%。重组蛋白His-OmpU和标签蛋白His-tag在IPTG诱导后在全菌、上清液和沉淀中均成功表达。用Ni-NTA柱纯化上清液也得到了具有活性的蛋白,考马斯亮蓝染色和Western blot结果均表明已获得正确的重组蛋白。为了探究重组蛋白His-OmpU作为亚单位疫苗对黄颡鱼的保护效果,分别用重组蛋白His-OmpU、拟态弧菌灭活疫苗、His标签蛋白和PBS免疫黄颡鱼。接种后第28 d用拟态弧菌进行攻毒,结果表明,His-OmpU组和灭活疫苗组的存活率远高于His-tag组和PBS组,分别为79.99%和68.00%。为了充分了解其潜在机制,我们在疫苗接种后28 d和感染拟态弧菌后24 h检测了黄颡鱼脾脏中白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、白介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、免疫球蛋白M(Ig M)、免疫球蛋白D(Ig D)、补体C3、主要组织相容性复合体(MHC)Iα类和MHC IIα类共十种免疫相关基因的表达水平。结果表明,大多数检测到的免疫相关基因在His-OmpU组和灭活疫苗组中均显著上调。另外,我们进行了血清杀菌活性测定,结果表明,His-OmpU组和灭活疫苗组的血清比His-tag组和PBS组对拟态弧菌具有更强的杀菌活性。最后,我们检测了血清凝集抗体,结果表明可以在His-OmpU组和灭活疫苗组的血清中检测到抗体,抗体滴度随接种后时间的增加而增加,而在His-tag或PBS组中则没有观察到抗体的凝集。我们的研究结果表明,His-OmpU诱导了有效的保护性免疫应答,该重组蛋白是针对黄颡鱼拟态弧菌的有效疫苗候选物。