亚胺还原酶在四氢异喹啉催化合成中的研究

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四氢异喹啉(THIQs)是有机胺中一类特殊的化合物,因具有该特殊手性骨架的化合物通常带有特殊的生物活性而在医药合成领域拥有广泛的应用价值。然而,目前工业上四氢异喹啉合成工艺的发展因其主要采用的化学合成法与金属催化法合成被操作繁琐、催化剂昂贵、对映体选择性差等问题而饱受限制。而亚胺还原酶(IRED)不对称催化还原因具有反应条件温和、环境友好、选择性高等优点成为了四氢异喹啉合成应用研究中的一个新兴方向。然而,目前对四氢异喹啉具有催化能力的亚胺还原酶报道还较少,具有S型对映体选择性的研究成果更是凤毛麟角。因此,本论文着力于通过基因工程与蛋白质工程手段,以获得对四氢异喹啉的工业合成具有应用价值的S型亚胺还原酶。首先,基于前期实验室亚胺还原酶的挖掘研究成果,我们选取其中来自Amycolatopsis decaplanina DSM 44594 以及 Saccharothrix espanaensis DSM 44229具有催化活性的两个亚胺还原酶——AdIR1和SeIR2,完成了它们在E.coli BL21(DE3)中异源表达体系的构建。通过酶活测定,我们了解到它们对模式底物1-甲基-3,4-二氢异喹啉具有1.27和1.39 U/mg的催化活力。通过反应测定,我们发现两者6小时可以完成5 mM底物的完全转化,且产物都为S型。然后,我们对纯化的AdIR1和SeIR2进行了各项酶学性质的表征,结果:AdIR1和SeIR2的最适催化温度皆为60℃;两者都具备良好的热稳定性,30℃下半衰期分别为70和58.4 h;最适催化pH亦都为7.0;在动力学上,Km分别为0.16和0.09 mM,kcat分别为0.79和0.69 s-1,催化常数(kcat/Km)分别为4.96和7.67 s-1 mM-1,但两者都有底物抑制现象,Ki值分别为3.33 mM和8.29 mM;底物谱考察结果显示,两者对二氢异喹啉同系物具有明显的催化效果,但催化效果大体随着一号位的取代基位阻增加而下降。接着,我们对1-苯基-3,4-二氢异喹啉具有更优质转化效果的AdIR1进行半理性改造,相较于母本8.0 mU/mg的活力,我们得到了具有1.9倍活力提升的突变体F172Y,其在40℃条件下甚至可以达到46 mU/mg。酶学性质表征显示:其具有优质的热稳定性,在30和40℃条件下的t1/2分别为324和314 h,两个参数都高于母本数倍;最适pH为7.0;在动力学表征上,F172Y的Km未增加,kcat提升了 3.4倍,即催化效率常数(kcat/Km)提升了 3.4倍。最重要的是,母本与突变体都未发现底物抑制情况,这是已知的第一例可以催化转化产生S型1-苯基-四氢异喹啉且不存在底物抑制的亚胺还原酶。之后,在30℃条件,1mM底物浓度的反应进程表征中,我们发现F172Y仅需要3小时便基本完成转化,用时仅母本的一半,且其ee值维持在99%。最后,我们通过反应筛选得到了最适反应温度为40℃和最适DMSO比例为2%(v/v),并在以上条件下,尝试了 2.05 g底物的转化反应制备,反应转化率为85%,最终得到0.34 g产物,产率为16.4%。
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