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环境雌激素可以通过与雌激素受体结合诱导鱼类肝细胞产生生物标志物---卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)。本研究利用Vtg与卵黄磷脂蛋白(Lipovitellin,Lv)同免疫原性的特点,初步建立了一个用Lv抗血清检测卵黄蛋白原的方法。
将成熟雌性唐鱼在4℃冰浴下取卵巢,10000rpm离心60min,上清液在4%-15%梯度Native-PAGE显示Lv分子量为314kDa。纯化Lv免疫大鼠获得多克隆抗血清。抗血清与经17β-雌二醇(E2)诱导的雄性唐鱼、雌性唐鱼以及唐鱼卵巢的匀浆液能发生免疫反应,并且印迹位置与雌性特异蛋白Vtg的位置相当。但是抗血清和未经E2诱导的雄鱼整体匀浆液并无反应,显示Lv的抗血清与Vtg和Lv两种蛋白是特异结合的。结果表明,唐鱼Lv的抗血清可用于检测唐鱼的Vtg。
Native-PAGE分析表明,在E2的诱导下,雄性唐鱼体内产生雌性特异蛋白Vtg,并且在体内积累。利用Mg2+-EDTA选择性沉淀和阴离子交换层析的两步纯化方法可分离纯化唐鱼Vtg。经Native-PAGE鉴定唐鱼Vtg的分子量为440kDa。以唐鱼Lv抗血清为抗体,Lv作为标准品建立间接ELISA,可用于检测整体匀浆中Vtg的含量,检测浓度为4-256ng/mL,Lv抗血清最佳稀释度为1:4000,批内误差为2.286%,批间误差为5.618%,灵敏度为8.775ng/mL。
用不同品牌的奶粉投喂唐鱼90天,用常规方法在奶粉中未能检测出雌激素(雌二醇、雌酮、己烯雌酚);但是,利用本文建立的ELISA方法却能检测出两种全脂奶粉诱导雄性唐鱼体内产生的Vtg蛋白量分别为42.84ng/g和53.67ng/g。本研究是利用雌激素效应物质Vtg作为生物标志物,检测奶粉中的雌激素效应物质,具有一定的应用价值。