研究背景在过去的30年里全球糖尿病患者数量增加超过2倍，这使糖尿病成为所有国家面临的具有挑战性的重大公众健康问题之一。国际糖尿病联盟最新统计数据显示，“2013年全球糖尿病患病人数为3.82亿；预计到2035年，全球糖尿病患者将达到5.92亿，糖耐量异常患者为4.71亿。此外，2013年全球共有510万人死于糖尿病相关疾病（占总死亡人数的8.39%），糖尿病全球医疗费用达5480亿美元（占全球医疗支出的11%）”。我国糖尿病患病人数居全球首位。2013年我国糖尿病患者人数为1.14亿；到2035年，中国的糖尿病患病人数将达到1.43亿。故而，采取有效的措施防治糖尿病及其并发症意义重大。“糖尿病是冠心病的重要危险因素”。每年死亡的糖尿病患者中，大约2/3是由于心血管并发症所致；糖尿病患者发生心肌梗死的风险增加3倍。基础研究也证实，糖尿病动物心肌易损性增加[1]。然而，高糖“毒性”并不能完全解释这一现象。系列临床试验发现，强化降糖对于降低高危患者心血管事件的发生并无益处[2,3]。据此，“治疗2型糖尿病的理念已经从单纯降糖向控制可导致心血管疾病的多重危险因素转变”。2型糖尿病患者不仅糖脂代谢异常，蛋白质代谢也存在问题。然而，作为能量物质之一的蛋白质，尤其是支链氨基酸（branched chain amino acids，BCAA）在心肌损伤中的作用却知之甚少。临床数据显示，糖尿病患者血浆中BCAA含量显著增加[4]， BCAA参与肥胖症患者胰岛素抵抗发生发展[5]。该结果提示我们，BCAA可能在疾病的发生发展中扮演重要的角色，绝非是伴随现象。BCAA致使2型糖尿病患病风险增加5倍[6]；血浆中BCAA及其代谢产物与胰岛素抵抗紧密相关[7-9]。数据还显示， BCAA及其代谢产物预测糖尿病发病。且独立于胰岛素抵抗和糖尿病，BCAA与冠心病严重程度紧密相关[10]。然而，高BCAA血症是否具有直接的心脏损伤作用尚不清楚。脂联素具有调节糖类、脂质代谢[11]及心血管保护作用[12]。2013年3月发表在Diabetes杂志上的数据显示，脂联素治疗2周可以改善骨骼肌BCAA水平。众多研究还显示，高血浆脂联素人群患2型糖尿病的危险性较低[13]，糖尿病患者血浆脂联素含量显著减少[11]。然而，低脂联素血症是否与糖尿病BCAA积聚有关；且脂联素通过何种机制影响BCAA分解代谢尚未见报道。据此，我们的科学问题是1独立于糖尿病其他危险因素，高BCAA血症是否加重心肌损伤，其机制是什么？2糖尿病患者BCAA升高的原因和机制是什么?研究目的1明确高BCAA血症是否加重心肌缺血/再灌注损伤，其机制是否与氧化应激有关。2明确低脂联素血症是否参与糖尿病BCAA升高，并阐明其介导糖尿病BCAA分解代谢障碍的机制。研究方法1高BCAA血症通过诱发氧化应激加重小鼠心肌缺血/再灌注损伤1.1制备心肌缺血/再灌注损伤模型：用6-0丝线结扎小鼠左冠状动脉并打一活结造成心肌缺血，缺血40mins后打开活结。分别在再灌注3hs （检测凋亡、 ROS及蛋白含量）以及灌注24hs（检测心肌梗死面积、心功能及线粒体形态）。 Sham组采用同样的手术方法，但不结扎小鼠左冠状动脉。1.2小动物超声检测小鼠心脏功能。1.3伊文氏蓝/TTC双染法检测小鼠心肌梗死面积。1.4酶分析试剂盒检测血浆中BCAA含量。1.5透射电镜观察线粒体形态。1.6TUNEL染色及Caspase-3活性作为检测凋亡的指标。1.7DHE染色检测ROS含量。1.8Western blot法检测MnSOD蛋白表达。2APN-AMPK-PP2Cm信号通路受损是糖尿病支链氨基酸分解代谢障碍的机制2.1制备2型糖尿病小鼠模型：60%HD喂养雄性C57BL/6小鼠6周，第2周腹腔注射低剂量STZ。STZ诱导第4周（HD喂养第6周）检测小鼠随机血糖≥200mg/dL为2型糖尿病造模成功指标。2.2肝脏细胞siRNA（AMPKα1siRNA，AMPKα2siRNA）转染：制备siRNA-siRNA-mate复合物并将其逐滴滴加到每孔细胞中，轻轻混匀。将细胞置于37℃含5%CO2的培养箱中孵育。孵育6h后用含10%胎牛血清的DMEM孵育；48h后收集细胞，Western blot法检测转染效率。2.3HPLC检测血浆及培养细胞上清中BCKA含量。2.4酶分析法试剂盒检测血浆中BCAA含量。2.5Western blot法检测AMPKα、 AMPKα1、 AMPKα2、 P-AMPKα、 PP2Cm、P-BCKD E1α、 BCKD E1α蛋白含量。2.6RT-PCR法检测PP2Cm和脂联素mRNA含量。2.7IPGTT检测葡萄糖耐量。2.8ELISA法检测血浆中脂联素含量。2.9检验科检测血浆胰岛素含量。2.10检验科检测甘油三脂水平。研究结果1高BCAA血症通过诱发氧化应激加重小鼠心肌缺血/再灌注损伤1.1高BCAA血症小鼠心肌缺血/再灌注损伤增加与WT小鼠比较，高BCAA血症小鼠心肌缺血/再灌注损伤加重。表现为心肌梗死面积增加，心功能恶化。1.2高BCAA血症小鼠心肌缺血/再灌注诱导的细胞凋亡增加与WT小鼠比较，高BCAA血症小鼠心肌组织缺血/再灌注诱导的TUNEL阳性显著增加， Caspas-3活性也显著增加。1.3高BCAA血症小鼠心肌缺血/再灌注诱导的氧化应激加剧与WT小鼠比较，高BCAA血症小鼠心肌缺血/再灌注诱导的ROS生成增加，MnSOD代偿性增加被抑制； SOD类似物（MnTBAP）治疗，减少ROS含量，改善心肌线粒体损伤。1.4SOD类似物治疗改善高BCAA血症小鼠心肌缺血/再灌注损伤再灌注前10min给予SOD类似物（MnTBAP）治疗，高BCAA血症小鼠心脏功能改善、心肌梗死面积减少、心肌细胞凋亡减少。2APN–AMPK-PP2Cm信号通路受损是糖尿病支链氨基酸分解代谢障碍的机制2.1ob/ob及诱导的2型糖尿病小鼠肝脏组织PP2Cm mRNA和蛋白水平显著减少与WT小鼠比较， ob/ob及诱导的2型糖尿病小鼠血浆中BCAA和BCKA含量显著增加；肝脏中P-BCKD E1α水平显著增加；糖尿病小鼠肝脏中PP2CmmRNA水平及蛋白丰度显著下调。2.2脂联素敲除小鼠肝脏中PP2Cm含量及BCKD活性显著下降，BCKA含量显著升高与HD喂养的WT小鼠相比， HD喂养的APN-/-小鼠血浆中BCAA和BCKA含量显著增加。重要的是， HD喂养的APN-/-小鼠肝脏中BCKD活性及PP2Cm含量显著下调。给予外源性脂联素治疗HD喂养的APN-/-小鼠3天，结果发现，脂联素治疗显著逆转血浆BCAA和BCKA水平，同时增加肝脏中BCKD活性及PP2Cm蛋白水平。2.3脂联素治疗显著上调糖尿病小鼠肝脏BCKD活性及PP2Cm含量，降低BCKA水平；但是PP2Cm部分介导了脂联素激活BCKD活性的作用脂联素治疗3天显著减少BCAA和BCKA水平，增加BCKD活性。此外，脂联素治疗显著上调糖尿病小鼠肝脏中PP2Cm mRNA水平和蛋白丰度。但是，PP2Cm-/-小鼠部分保留了脂联素激活BCKD的作用。也就是说，脂联素治疗的PP2Cm-/-小鼠血浆中BCAA及BCKA含量、肝脏组织中P-BCKD水平均显著高于脂联素治疗的ob/ob及WT小鼠。2.4脂联素依赖AMPK促进BCKA分解代谢AMPK激动剂AICAR显著减少糖尿病小鼠血浆及培养的肝脏细胞上清中BCAA及BCKA含量，增加糖尿病小鼠肝脏组织和细胞中BCKD活性，同时还上调PP2Cm蛋白表达；AMPK抑制剂CC完全阻断了脂联素促进BCKA氧化脱羧分解的作用。2.5AMPKα2介导脂联素调节BCKA分解代谢与对照及AMPKα1siRNA组比较，转染AMPKα2siRNA及高BCKA孵育的肝脏细胞中PP2Cm蛋白含量和BCKD活性显著下降，培养上清中BCKA含量增加。 AMPKα2siRNA也完全阻断了脂联素上调PP2Cm表达、 BCKD活性及促进BCAA分解的作用。研究结论1本课题证实了高BCAA血症加重小鼠心肌缺血/再灌注损伤。其机制是高BCAA抑制缺血/再灌注诱导的MnSOD代偿性增加， ROS清除被抑制，心肌细胞凋亡增加。2本研究证实了APN-AMPK-PP2Cm信号受损是糖尿病BCAA分解障碍的机制之一。除此，我们的实验还证实了脂联素通过AMPK上调PP2Cm含量。这些发现为我们进一步阐明糖尿病BCAA分解代谢障碍的机制提供了新的证据，也为临床治疗代谢性疾病提供了新的靶点。