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镰刀菌属(Fusarium spp.)分布广泛,形态多样,种类繁多。其寄主范围广,能够感染人类、动物,侵染植物,引起镰刀菌病。近年来由于免疫力低下人群增多,导致侵袭性和播散性镰刀菌感染逐年增多。该属已成为真菌性角膜炎最常见的病原菌,在丝状真菌深部感染中仅次于曲霉属(Aspergillus spp.)居于第二位。镰刀菌感染严重危害人类健康,特别是播散性镰刀菌感染的病死率极高。镰刀菌是天然多重耐药真菌。在临床上,该菌对几乎所有的抗真菌药物都具有耐药性,包括唑类、棘白菌素类及多烯类药物。目前,对于病原真菌的耐药机制研究多集中于临床感染较多的假丝酵母属(Candida spp.)和曲霉属。其耐药性形成大多数是由靶基因变异引起,例如对唑类药物产生耐药多是由于羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)突变。此外还有形成生物膜、药物外排、药物降解等机制。而关于镰刀菌耐药机制的研究报道较少,因此对其耐药性产生的机制研究迫在眉睫。本研究成功构建了含有G418抗性基因(neo)筛选标签的质粒pXEN。利用该质粒对尖孢镰刀菌(F.oxysporum)成功进行了根癌农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterimu tumefaciens-mediated transformation,ATMT),并对影响转化效率的主要因素进行了优化,建立了高效、稳定的ATMT转化体系。优化后,转化效率达250个转化子/10~4个孢子。利用该转化体系获得了1450株尖孢镰刀菌T-DNA插入突变体,初步建立了耐药尖孢镰刀菌的突变体库。生物学性状和核酸分析表明,获得的突变体遗传稳定性好,并可通过TAIL-PCR扩增技术获得突变体的插入位点侧翼序列,通过生物信息学分析确定打断基因。这为尖孢镰刀菌耐药、致病等相关机制的解析提供了突变体资源。本研究对上述尖孢镰刀菌突变体进行了药物敏感性筛选,分析了其对唑类、多烯类及棘白菌素类药物敏感性的变化,获得了一株对唑类药物敏感性改变的突变体FOM1123,对除氟康唑以外的唑类药物敏感性均明显增强,而对两性霉素B、卡泊芬净的最小抑菌浓度(MIC)均未见改变。利用TAIL-PCR获得了突变体FOM1123的T-DNA插入位点侧翼序列,与NCBI数据库比对发现假定蛋白基因(hypothetical protein gene,HPG)和NADPH-细胞色素P450还原酶基因(NADPH-cytochrome P450 reductase,CPR1)被打断。为了明确影响该突变体药物敏感性的基因,对这两个基因分别进行基因敲除,获得敲除株ΔCPR1和ΔHPG。药物敏感性实验结果发现,ΔCPR1的药物敏感性增强,与突变体FOM1123一致;而ΔHPG无改变,表明药物敏感性改变仅与CPR1相关。有研究表明,NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)和细胞色素b5(cyt b5)是生物体内的电子传递蛋白。在真菌中两者可以为甾醇合成过程中的关键酶CYP51提供电子。生物信息学分析显示,CPR在尖孢镰刀菌中存在四个同源基因,即CPR1、CPR2、CPR3及CPR4;CYP51存在三个同源基因,即CYP51A、CYP51B及CYP51C。为了分析CPR、cyt b5及CYP51与尖孢镰刀菌唑类耐药的关系,本研究检测了它们在野生型和ΔCPR1中转录水平的变化。结果显示,与野生型相比ΔCPR1中CPR2、cyt b5、CYP51A、CYP51B基因表达均上调。野生型在受到伏立康唑胁迫后,CPR两个同源基因CPR1、CPR2、cyt b5、CYP51A、CYP51B表达均上调。为了探讨CPR另外三个同源基因与尖孢镰刀菌唑类耐药的关系,分别对其进行了敲除,结果表明三个同源基因与唑类耐药无关。麦角甾醇含量分析显示,与野生型相比,ΔCPR1麦角甾醇含量降低,在受到伏立康唑胁迫时,ΔCPR1与野生型麦角甾醇含量均明显降低。以上结果表明,CPR1是尖孢镰刀菌麦角甾醇合成通路中的关键基因,是唯一与唑类耐药相关的CPR,其缺失可影响麦角甾醇的合成,导致对唑类药物敏感。综上所述,本研究成功建立了根癌农杆菌介导的尖孢镰刀菌遗传转化体系,构建了耐药尖孢镰刀菌的T-DNA插入突变体库,并深入分析了CPR基因与耐药性的关系。研究发现该基因与麦角甾醇的合成相关,缺失会导致麦角甾醇合成量降低,对唑类药物敏感。上述结果为寻找新型抗真菌药物靶标、揭示病原真菌的耐药机制奠定了基础,也为其他病原真菌相关研究提供了参考和借鉴。