甲壳低聚糖(Chitooligosaccharides,COS)是壳聚糖(Chitosan,CTS)的降解产物,不仅具有壳聚糖大分子的某些功能性质,而且还具有许多壳聚糖所不具备的独特的生理活性和功能性质。本文旨在通过研究不同的非专一性酶对壳聚糖的降解效果,探索酶法降解壳聚糖制备甲壳低聚糖有效方法,并对低聚糖相对分子量分布范围进行了初步研究。1、选用纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等5种酶,对壳聚糖进行降解试验。通过单因素试验,以还原糖释放量为指标,探讨以上5种酶降解壳聚糖的工艺条件。试验结果表明:在试验选取的范围内,5种酶降解壳聚糖所需时间依次为5h、3h、5h、4h和3h;果胶酶、枯草杆菌蛋白酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶酶解壳聚糖最适温度均为50℃,胃蛋白酶为55℃;果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的最适加酶量均为5%,而枯草杆菌蛋白酶为7%;各酶降解壳聚糖最适底物浓度均为1%;考虑到降解产物一般在近中性的条件下使用,为方便降解产物调节适宜的pH,采用pH5.0作为各酶降解壳聚糖的酸碱条件。通过对各酶降解壳聚糖的酶活力、酶解液中还原糖释放量,以及各酶降解壳聚糖的粘度下降率3个指标的综合比较,得出各酶降解壳聚糖的能力大小为:纤维素酶>木瓜蛋白酶>胃蛋白酶>枯草杆菌蛋白酶>果胶酶。2、分别运用正交试验设计法优化纤维素酶和木瓜蛋白酶降解壳聚糖的工艺条件,得出纤维素酶降解壳聚糖最佳工艺参数为:加酶量5%,底物浓度1.25%,酶解时间6 h,酶解温度为55℃,pH5.0;木瓜蛋白酶降解壳聚糖最佳工艺参数为:加酶量7%,底物浓度1.25%,酶解时间6 h,酶解温度为55℃,pH5.0。将原料壳聚糖胶体、壳聚糖酶解液分别过Sephadex G-100凝胶色谱柱,发现原料壳聚糖相对分子量主要分布范围为3.5×10~5～1.2×10~5;纤维素酶酶解壳聚糖,产物相对分子量主要分布范围为8.4×10~3～2.2×10~3(洗脱体积为104～130 mL),小部分分布在相对分子量3.2×10~5～1.7×10~5的范围内(洗脱体积为34～46 mL);木瓜蛋白酶解降解壳聚糖,产物相对分子量分布范围分别为3.2×10~5～1.0×10~5(洗脱体积34～56 mL)、1.2×10~4～2.7×10~3(洗脱体积98～126 mL)。从分子量分布来看,纤维素酶和木瓜蛋白酶均未能对壳聚糖彻底降解。3、应用复合酶解技术,通过调整纤维素酶和木瓜蛋白酶的组合比例,探讨不同比例的复合酶对壳聚糖的降解效果。结果表明:纤维素酶与木瓜蛋白酶按1:2的比例降解壳聚糖,还原糖浓度最高。采用二次回归旋转组合试验设计方案,建立了加酶量(X1)、酶解温度(X2)、酶解时间(X3)与粘度下降率(Y1)和还原糖释放量(Y2)之间的动态数学模型。试验结果的方差分析显示,方程Y1相关系数R2为97.63 %,F值为59.5919,显著性系数为0.0001,模型的符合度为97.63%;方程Y2的相关系数R2为97.69%,F值为61.0413,显著性系数为0.0001,说明两个回归方程是极显著的,能够较为准确的预测酶解实际效果。运用响应面法对工艺条件进一步优化,得到复合酶降解壳聚糖的最佳工艺条件为:加酶量7.70%,酶解温度50℃,酶解时间5 h,壳聚糖浓度1.25%,pH5.0。在此条件下对壳聚糖糖进行降解,壳聚糖粘度下降率达到97.21%,还原糖浓度达到2.47 mmol/L,均高于纤维素酶和木瓜蛋白酶的单一酶解效果。同样将降解产物过Sephadex G-100凝胶色谱柱。洗脱曲线显示:降解产物相对分子量分布于1.0×10~4～2.7×10~3和2.3×10~5～1.1×10~5之间。与原料壳聚糖胶体的洗脱曲线相比,使用复合酶降解壳聚糖效果显著,大部分产物相对分子量低于1×10~4。