研究背景半个世纪以来,恶性肿瘤已经成为严重影响并制约全球人类健康的主要因素,其发病率及致死率也逐年增高。在我国,消化系统肿瘤一直是医护和科研工作者关注及研究的重点,而近几年来肝细胞肝癌的发病率已经跃居肿瘤发病的第五位,其致死率却已跃居第二位。然而由于肝细胞肝癌早期症状不明显且发病相对缓慢,病人一经确诊往往已经错过了手术及化疗的最佳时期。因此,研究肝细胞肝癌的发病机制,并寻找治疗肝细胞肝癌的新型分子靶向药物已经成为医学研究领域的热点。肿瘤坏死因子a诱导蛋白8〔Tumor necrosis factor (TNF)-alpha-induced protein8, TNFAIP8),简称TIPE,亦称为SCC-S2、GG2-1、MDC-3.13,目前发现其与TIPE1、TIPE2和TIPE3在氨基酸序列和分子结构上具有较高的同源性,共同组成TIPE蛋白家族。TIPE是该家族中最先被发现的成员,最初发现于人头颈鳞癌,通过差异显示技术分析原位头颈鳞癌细胞与转移癌细胞间差异表达的基因,发现SCC-S2基因(即为TIPE)在转移癌细胞中的表达显著升高。随后,在人体的多种正常组织中均检测到TIPE分子的表达,其中脾、淋巴结、胸腺、甲状腺、骨髓、胎盘组织中呈现高表达,而在脊髓、卵巢、肺、肾上腺、心脏、脑、骨骼肌中表达较低。另有研究报道,TIPE在人类肿瘤组织中,包括乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和食管癌中表达上调,且与肿瘤的生长转移和预后具有相关性。然而TIPE是否参与肝细胞肝癌的发生发展过程,目前尚无文献报道,因此本课题以TIPE为研究对象,探讨其在肝细胞肝癌发生发展中的生物学作用及其分子机制。研究目的1.研究TIPE在肝细胞肝癌中的表达变化,分析其临床意义。2.探讨TIPE在肝细胞肝癌发生发展中的作用及其分子机制,进一步阐明肝细胞肝癌的发病机理,为临床生物治疗提供潜在的分子靶点。研究方法1TIPE基因在肝细胞肝癌及其相应癌旁组织中的表达水平及临床意义研究1.1TIPEmRNA和TIPE蛋白表达水平的检测收集16例新鲜HCC组织标本,用Trizol方法提取癌组织和相应癌旁组织的总RNA, RT-PCR方法检测TIPE mRNA的表达水平。同时,收集145例HCC石蜡标本,用IHC方法检测癌组织及癌旁组织TIPE蛋白的表达水平。1.2TIPE蛋白的表达与临床指标的相关性分析统计学分析肝癌组织中TIPE表达与相应临床指标的相关性(包括肿瘤直径大小、肿瘤病理分级分期、肿瘤血管淋巴转移及预后等指标)。2TIPE分子对肝癌细胞体内外生长的影响2.1检测各种肝癌细胞系中TIPE表达情况Trizol方法提取SMMC7721、QSG7701、HepG2.2.15、HepG2、BEL7402五种肝细胞系的总RNA, RT-PCR方法检测TIPE mRNA的表达水平。2.2TIPE对肝癌细胞生长的影响取生长状态良好的人肝癌细胞系HepG2和BEL7402,分别转染TIPE siRNA或阴性对照siRNA(NC siRNA),或者在HepG2细胞中过表达TIPE, CCK-8方法绘制生长曲线,观察TIPE对肝癌细胞体外生长的影响。2.3TIPE对肝癌细胞体内生长的影响利用小鼠肝癌细胞系H22建立皮下移植瘤模型,分别瘤内注射质粒pRK5-mTIPE或pRK5质粒,,绘制肿瘤的生长曲线；处死小鼠后,分离肿瘤组织,称瘤重,RT-PCR检测肿瘤组织中TIPE的表达。3TIPE蛋白对肝癌细胞体外转移能力和EMT转化的影响3.1利用Transwell小室,分别进行体外的迁移和侵袭实验：分别将TIPE siRNA或NC siRNA转染HepG2和BEL7402细胞,24h后转种于未处理的或预先铺Matrigel的transwell小室之上室,染色后显微镜下计数并分析两组细胞迁移、侵袭能力的差异。3.2TIPE对肝癌细胞中EMT相关标志分子和转录因子表达的影响结合文献报道,上皮间质转化(EMT)在肝细胞肝癌侵袭转移过程中发挥关键作用。因此,本课题检测了TIPE对肝细胞中EMT相关标志分子和转录因子表达的。取状态良好的HepG2和BEL7402两种细胞,分别转染TIPE siRNA或NCsiRNA,同时在HepG2中过表达TIPE,48h后Westernblot检测EMT相关分子(E-cadherin, N-cadherin, Vimentin)及转录因子(Slug, Snail, Twist)的表达情况。4Rac1在TIPE调控肝癌细胞增殖转移中的作用研究4.1TIPE对Racl活化的影响BEL7402细胞分别转染TIPE siRNA或NC siRNA,或共转染Ras正性突变体H-Rasl2V质粒。Pull-down试验检测Rac1-GTP水平的变化情况。同时,收取总蛋白检测总Rac1水平。4.2Racl在TIPE调控肝癌生长中的作用HepG2和BEL7402两种细胞分别共转TIPE siRNA或/和Racl siRNA或NC siRNA, CCK-8绘制各组细胞生长曲线,统计学分析组间差异。4.3Racl参与TIPE调控肝癌体外转移的作用研究HepG2和BEL7402两种细胞分别共转TIPE siRNA或/和Rac1siRNA或NC siRNA, Transwell方法检测细胞的迁移和侵袭能力,并进行统计学分析。研究结果1TIPE在肝细胞肝癌组织中表达下调且具有显著的临床意义1.1肝细胞肝癌组织中TIPE表达显著降低RT-PCR结果显示,所收集的16对HCC组织中,其中有11/16例(69%)癌组织中TIPE mRNA的表达明显低于相应癌旁组织。IHC结果显示：正常肝血管瘤肝组织和癌旁组织均表达较高水平的TIPE蛋白,而癌组织中TIPE的表达显著降低。1.2肝癌组织TIPE蛋白的表达与临床指标具有显著相关性统计学分析TIPE蛋白表达与HCC相关临床指标及患者预后关系,结果显示TIPE蛋白表达与肿瘤直径、病理分级、TNM分期、淋巴管血管侵袭呈现负相关,而与患者生存期显著正相关。2TIPE可在体内外显著抑制肝细胞肝癌的生长2.1肝细胞系可表达不同水平的TIPE mRNAQSG7701、HepG2.2.15, BEL7402细胞系中TIPE mRNA的表达相对较高,而HepG2细胞表达中等水平的TIPE mRNA。本课题选择HepG2、BEL7402两种细胞系进行干扰试验,同时HepG2进行了相应的过表达实验。2.2TIPE可抑制肝癌细胞系的体外生长BEL7402细胞、HepG2细胞瞬时转染TIPE siRNA及对照siRNA,生长曲线实验结果显示,TIPE siRNA可显著促进细胞增殖,而TIPE过表达则可显著抑制HepG2细胞的增殖,提示TIPE具有抑制肝癌细胞体外增殖的生物学作用。2.3TIPE过表达可显著抑制小鼠皮下移植瘤的生长以小鼠肝癌细胞系H22制备BALB/c小鼠皮下成瘤模型,成瘤后分别瘤内注射pRK5-mTIPE或对照质粒pRK5。肿瘤生长曲线显示,pRK5-mTIPE注射组肿瘤生长速度较pRK5注射组显著减慢,瘤重也明显减轻。RT-PCR结果显示,pRK5-mTIPE注射组肿瘤组织中TIPE mRNA表达水平显著高于对照组。3TIPE可通过EMT机制抑制肝癌细胞的侵袭转移能力3.1TIPE可下调肝癌细胞系的体外侵袭迁移能力Transwell实验结果显示：TIPE siRNA转染组BEL7402细胞、HepG2细胞迁移和侵袭的细胞数量显著高于对照组细胞,而HepG2细胞中过表达TIPE之后,细胞迁移侵袭数量明显低于对照组,提示TIPE可抑制肝癌细胞的体外侵袭迁移能力。3.2TIPE可调控EMT相关分子及其转录因子的表达鉴于EMT机制在肝癌转移中的重要作用,研究检测了TIPE对EMT标志分子及相关转录因子表达的调控作用。Western blot检测发现,TIPE siRNA可下调上皮标志分子E-cadherin的表达,而明显上调间质标志分子N-cadherin、Vimentin,且EMT相关转录因子Slug、Snail、Twist亦随之上调,TIPE过表达则发挥相反的作用。以上结果提示TIPE可能通过调控EMT转化,抑制肝癌细胞侵袭迁移能力。4Rac1参与TIPE对肝细胞肝癌生长转移的抑制作用Rac1属于Ras超家族成员,参与调控多种生命活动过程,Rac1活性的升高在肿瘤发生发展中发挥重要作用。因此,课题检测了TIPE对Rac1活化水平的影响,以及Rac1在TIPE抑制肝癌生长和转移中的作用。4.1TIPE可抑制Rac1的活性Pull-down试验结果显示：干扰TIPE表达之后,细胞本底水平或Ras正性突变体转染细胞中Racl-GTP水平均显著高于对照组细胞,提示TIPE可抑制Rac1活化。4.2Rac1参与TIPE对肝癌细胞生长的抑制作用HepG2和BEL7402细胞单独或共转染TIPE siRNA、Rac1siRNA及对照siRNA,生长曲线结果显示：TIPE siRNA可促进肝癌细胞生长,而Rac siRNA发挥抑制作用,且可中和TIPE siRNA对细胞生长的促进作用,提示Rac1参与TIPE对肝癌细胞生长的抑制作用。4.3Rac1参与TIPE对肝癌细胞转移的抑制作用Transwell结果显示TIPE siRNA可促进肝癌细胞迁移侵袭的能力,而RacsiRNA发挥抑制作用,且可中和TIPE siRNA对细胞侵袭、转移的促进作用,提示Rac1参与TIPE对肝癌细胞转移的抑制作用。结论1. TIPE分子在肝细胞肝癌组织中表达下调,并且与肿瘤病理分级、TNM分期、肿瘤大小、预后有其明显的相关性,提示TIPE可能参与肝细胞肝癌的发生发展过程。2. TIPE可在体内外显著抑制肝癌细胞的生长。3. TIPE具有抑制肝癌细胞迁移和侵袭能力的作用,并且可抑制EMT转换的进程。4. TIPE可负向调控Rac1的活化,并且参与了TIPE对肝癌细胞生长和转移的抑制作用。创新性和研究意义：1.首次发现TIPE在肝细胞肝癌组织中表达下调,且与临床指标具有显著相关性,为充分阐明TIPE蛋白在不同肿瘤发生中的作用提供重要临床依据。2.首次研究TIPE在肝细胞肝癌发生发展中的生物学功能,发现TIPE可显著抑制肝癌生长和转移过程,为肝细胞肝癌的临床生物治疗药物研发提供新的分子靶点。研究背景：肝细胞肝癌是我国发病率及致死率极高的恶性肿瘤之一,因其恶性度高,治愈率低,预后差,严重影响人类健康及生活质量,一直以来是困扰医学临床及科研人员的课题,近几十年来,由于肿瘤分子机制的不断深入探索,期待从分子水平上寻找治愈肝细胞肝癌的靶点已经成为医学研究的热点。泛素-蛋白酶系统介导蛋白质的降解发挥着重要的生物学功能,参与细胞凋亡,炎症,细胞增殖与分化,细胞周期的进程,转录调控,抗原递呈等重要的生命活动过程。泛素-蛋白酶系统对底物蛋白的特异性由泛素连接酶E3所决定的,因此对泛素连接酶生物学功能的研究引起了极大关注。近年来,研究证实泛素连接酶E3在肿瘤的发生发展中扮演重要的角色。Cullin家族就属于E3连接酶的范畴,该家族是高度保守的,目前发现其成员包含CUL1, CUL2, CUL3, CUL4A, CUL4B, CUL5, CUL7七个蛋白。CUL4A作为Cullin家族成员之一,结构功能与CUL4B有较高的相似性。CUL4A通过与ROC1环指蛋白、DNA损伤蛋白(DDB1)结合形成多功能泛素连接酶复合物,发挥其靶向降解底物蛋白(如P21,P53,P27等)的作用。研究发现,在鳞状细胞癌,肾上腺皮质腺瘤,儿童成神经管细胞瘤,恶性胸膜间质瘤中CUL4A呈高表达状态。另外,CUL4A在肝癌组织及细胞系中基因拷贝数增加,但CUL4A在肝细胞肝癌的发生发展中的具体生物学作用尚不明确。本课题着手于研究CUL4A在HCC中的表达及其对肝癌细胞恶性生物学行为的调控作用。研究目的：1.临床标本检测CUL4A在肝细胞肝癌组织中的表达变化,分析其临床意义,探讨其表达与肝癌发生发展的关系；2.研究CUL4A在肝细胞肝癌发生发展中的生物学作用及分子机制,进一步阐明肝癌的发病机理,为临床靶向治疗和诊断提供实验依据。研究方法：1. CUL4A在肝细胞肝癌组织中的表达变化及其临床意义研究1.1CUL4A在肝细胞肝癌组织及其相应癌旁组织中的表达差异收集57对HCC及相应癌旁组织,IHC方法检测CUL4A蛋白的表达情况,评价表达强度和范围,计算整体表达水平,统计学分析二者之间CUL4A的表达差异。1.2CUL4A表达与临床指标的相关性分析将肝癌组织中CUL4A的表达水平与相关临床指标(如：患者年龄、性别、肿瘤大小、病理分级临床分期、淋巴血管转移以及预后情况)进行了相关性分析,评价肝癌组织中CUL4A表达的临床意义。2CUL4A对肝细胞肝癌体外生长的影响及其分子机制研究2.1CUL4A对肝癌细胞生长的影响取生长状态良好的HepG2和BEL7402细胞,分别转染CUL4A siRNA或对照NC siRNA, CCK-8方法监测TIPE对肝癌细胞生长增殖的影响。2.2CUL4A对细胞周期的调控作用HepG2和BEL7402细胞,分别转染CUL4A siRNA或对照NC siRNA,48h后,PI染色、流式细胞术检测CUL4A对细胞周期进程的影响。同时,Western Blot检测与肿瘤细胞周期相关蛋白的表达情况。3CUL4A对肝细胞肝癌体外转移能力的影响及其分子机制3.1CUL4A对细胞迁移、侵袭能力的影响分别将CUL4A siRNA或对照NC siRNA转染HepG2和BEL7402细胞,Transwell方法检钡CUL4A对细胞迁移、侵袭能力的影响(具体方法同第一部分)。3.2CUL4A对EMT相关分子表达的调控作用进行上述transwell实验的同时,收取细胞总蛋白,Western Blot检测与EMT分子及其相应的转录因子的表达情况。研究结果1CUL4A在肝细胞肝癌组织中表达上调且具有显著的临床意义1.1肝细胞肝癌组织中TIPE蛋白表达升高IHC检测正常肝血管瘤肝组织及肝癌和相应癌旁组织中CUL4A蛋白的表达,结果显示正常肝血管瘤肝组织CUL4A的表达较低,而肝癌组织中CUL4A的表达明显高于相应癌旁组织,差异具有统计学意义。1.2CUL4A蛋白的表达水平与肝细胞肝癌的临床指标显著相关统计学分析CUL4A表达与HCC临床相关性指标以及患者预后的关系,结果发现CUL4A表达与直径、病理分级、淋巴组织血管侵犯呈正相关,而与患者生存期呈负相关,并且均有明显的统计学意义。2CUL4A可在体外显著促进肝细胞肝癌的生长2.1CUL4A可促进肝癌细胞系的体外生长能力BEL7402细胞、HepG2细胞经瞬时转染CUL4A siRNA及NC siRNA之后,CUL4A siRNA转染组细胞增殖能力显著降低,证实CUL4A的表达可促进肝癌细胞的生长增殖能力。2.2CUL4A可肝癌加速肝癌细胞的细胞周期进程PI染色结果显示,与对照组细胞相比,经CUL4A siRNA转染的BEL7402、 HepG2细胞,S期比例显著降低,提示CUL4A可以加速细胞周期的进程,可能在其促进肝癌细胞生长增殖中发挥重要作用。2.3CUL4A可影响细胞周期相关分子的表达siRNA沉默BEL7402、HepG2细胞中CUL4A的表达后,WB检测细胞周期分子的表达,结果显示CUL4A siRNA可下调Cyclin A,Cyclin B1蛋白的表达。3CUL4A可通过EMT机制抑制体外肝癌细胞的侵袭迁移能力3.1CUL4A可上调肝癌细胞系的体外侵袭迁移能力Transwell结果显示,干扰BEL7402细胞、HepG2细胞中CUL4A的表达,可显著降低其侵袭、迁移能力,提示CUL4A可参与调控肝细胞肝癌的转移过程。3.2CUL4A可影响EMT相关分子及其转录因子的表达将状态良好的BEL7402、HepG2细胞转染CUL4A siRNA后,Western blot检测发现上皮标志分子E-cadherin表达上调,而间质标志分子N-cadherin, Vimentin表达下调。相应地,EMT相关转录因子Slug, Snail, Twist均随着CUL4A的表达降低而下调,提示CUL4A可调控肝癌细胞的EMT转化机制,可能在其促进肝癌转移过程中发挥重要作用。结论1肝细胞肝癌中CUL4A蛋白表达明显上调,且与临床相关指标有一定相关性,提示CUL4A在肝细胞肝癌的发生发展过程中扮演重要角色。2CUL4A可促进肝细胞肝癌细胞的生长及细胞周期进程,可能在肝癌细胞的恶性增殖过程中发挥重要作用。3CUL4A可促进肝癌细胞的侵袭迁移能力,以及EMT转化机制,提示CUL4A可能参与肝癌转移过程。研究意义：本课题首次研究了CUL4A在肝细胞肝癌生长和转移中的生物学作用,为肝细胞肝癌的临床诊断和靶向治疗提供了理论依据。