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研究背景抗菌肽(peptides ialAntimicrob,AMPs)是指多种生物体通过自身的免疫系统产生的一类短肽。抗菌肽的通性如下:分子量小,阳离子蛋白,线性或是螺旋性的亲水性序列。抗菌肽具有抗菌谱广的优点,主要是通过破坏细胞膜的结构来达到抑菌效果。鱼精蛋白(protein Protamine,PP)是现今抗菌肽研究的热点之一,是一类富含精氨酸的小分子核酸蛋白,可取代组氨酸与DNA结合。既具有抗菌效果,同时也是用于心脏手术中中和肝素过量的唯一药物。但工业上是从许多鱼类和哺乳类动物成熟的精巢组织中提取鱼精蛋白,其产率低,成本高,纯化工艺复杂,原料受季节限制,所以本课题希望通过基因工程的方法制备鱼精蛋白。细胞珠蛋白(Cytoglobin,CYGB)是珠蛋白家族中新的一员,2001年因其和肝星状细胞一起协同作用而被发现,2002年将其命名为细胞珠蛋白。因CYGB蛋白在大肠杆菌表达系统中表达量极大,所以本课题希望借助CYGB蛋白实现目的蛋白的高效表达。研究目的(1)本课题旨在通过基因工程的方法高效制备鱼精蛋白。(2)本课题同时采用两种不同表达系统制备鱼精蛋白,目的是为了寻找鱼精蛋白最佳的表达体系。(3)本课题旨在优化纯化工艺,实现重组鱼精蛋白的工业化制备。研究方法(1)用基因工程的方法,采用大肠杆菌和昆虫细胞杆状病毒表达系统,制备鱼精蛋白。(2)在大肠杆菌表达系统中,采用鱼精蛋白与CYGB融合表达的方法,制备鱼精蛋白。(3)因在后续的纯化过程中需用CNBr切割CYGB-PP中的Met位点,本课题利用重叠延伸PCR法对融合基因CYGB进行定点突变得CYGBm,使得融合蛋白CYGB中不含Met位点(起始密码子除外)。研究结果(1)成功完成CYGB的定点突变及蛋白CYGBm的表达;(2)成功完成质粒pET22b-CYGBm-PP的构建、蛋白表达纯化及活性分析;(3)根据抑菌实验结果表明,重组鱼精蛋白具有抑菌活性;(4)计算出重组鱼精蛋白的收率为17.9%;(5)成功构建质粒pFastBacT1-PP-His-LIR-DsRed2和pFastBacT1-His-PPLIR-DsRed2。结论本论文实验结果证明,用基因工程的方法,通过原核表达系统融合表达的方式可以制备具有生物学活性的重组鱼精蛋白。昆虫杆状病毒表达系统生产鱼精蛋白,经荧光检测有目的蛋白存在,但Western blotting的验证结果与预期不符,该表达系统需进一步深入研究。本论文中用原核表达系统生产鱼精蛋白的研究,为工业化制备鱼精蛋白提供了一定的理论依据。