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目的:以三氯乙烯染毒B6C3F1雄性小鼠,筛选肝脏内差异表达的microRNA,在小鼠永生化肝细胞系BNL CL.2、小鼠肝癌细胞系Hepa1-6和人肝癌细胞系HepG2中进一步分析所筛选的miR-182-5p的DNA甲基化调控机制及其在三氯乙烯引起的细胞增殖中的作用,目的是了解三氯乙烯肝毒性的毒作用机制,为评估三氯乙烯对人肝脏的危害及其临床防治提供科学依据。方法:体内实验:将7周龄B6C3F1雄性小鼠随机分成4组,每组5只,以不同剂量三氯乙烯(0,100,500,1000 mg/kg b.w.)染毒5天,利用基因芯片筛选肝脏内差异表达的microRNA;以荧光定量PCR验证microRNA的表达,以荧光定量PCR和Western Blot检测预测靶基因mRNA和蛋白表达水平;以重亚硫酸盐测序方法检测microRNA启动子区DNA甲基化水平。细胞实验:用不同浓度三氯乙烯染毒处于对数生长期的BNL CL.2、Hepa1-6和HepG2细胞48小时,用MTT和平板克隆方法检测细胞增殖率和存活率;以流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡;以碱性彗星实验检测对DNA损伤的影响;以miR-182-5p抑制物和类似物转染BNL CL.2和Hepa1-6细胞,用MTT和EdU标记实验检测对三氯乙烯染毒细胞的增殖影响;以甲基化酶抑制剂5-aza-2’-dC和组蛋白乙酰化酶抑制剂TSA处理细胞,检测对miR-182-5p表达的影响;用荧光定量PCR和Western Blot检测预测靶基因的mRNA和蛋白表达。结果:(1)1000mg/kg b.w.三氯乙烯染毒5天的小鼠肝脏中有8个miRNA表达上调,1个miRNA表达下降,其中miR-182-5p上调表达最为显著,并与三氯乙烯浓度有剂量关系;同时三氯乙烯可引起miR-182-5p基因启动子区低甲基化;三氯乙烯还导致mi R-182-5p预测靶基因Dnmt3a、Dnmt3b和Cited2等的mRNA表达水平下降,其中Cited2的mRNA和蛋白表达均降低。(2)与对照相比,非细胞毒性剂量(0.1和/或0.3mM)的三氯乙烯染毒48h后可引起BNL CL.2、Hepa1-6和HepG2细胞不同程度的增殖加快;平板克隆实验发现可使这三种细胞系的克隆形成率升高,存活率增加;流式细胞仪检测发现BNL CL.2和Hepa1-6细胞G1期阻滞减小;但对这三种细胞系不引起显著的细胞凋亡和DNA损伤。(3)在小鼠BNL CL.2、Hepa1-6和人HepG2细胞中,0.1和0.3mM三氯乙烯浓度下可引起miR-182-5p表达增加,并引起BNL CL.2细胞内预测靶基因Dnmt3a、Dnmt3b和Cited2等的mRNA表达水平下降,其中Cited2的蛋白表达水平也降低;miR-182-5p抑制物可逆转三氯乙烯引起的细胞增殖;5-aza-2’-dC处理可引起miR-182-5p表达增加。结论:三氯乙烯可能通过抑制肝脏中Dnmt3a和Dnmt3b等DNA甲基转移酶,降低miR-182-5p启动子区的DNA甲基化水平,促进miR-182-5p表达上升,并可能通过抑制其预测靶基因Cited2的表达促进细胞增殖,从而导致肝癌发生率升高。