【摘 要】
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4β-NH-（5-氨基吲唑）-鬼臼毒素（5-ID-PTOX）的抗肿瘤活性达纳摩尔级,而临床抗肿瘤药物依托泊苷（VP-16）的抗肿瘤活性达微摩尔级,因此5-ID-PTOX具有良好的成药潜力。5-ID-PTOX的化学合成路线存在着对环境不友好等问题,因此有必要开发反应条件温和、绿色无污染的生物合成路线。本文拟通过挖掘、改造亚胺还原酶以用于合成5-ID-PTOX。分析5-ID-PTOX的化学结构特征,其
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4β-NH-（5-氨基吲唑）-鬼臼毒素（5-ID-PTOX）的抗肿瘤活性达纳摩尔级,而临床抗肿瘤药物依托泊苷（VP-16）的抗肿瘤活性达微摩尔级,因此5-ID-PTOX具有良好的成药潜力。5-ID-PTOX的化学合成路线存在着对环境不友好等问题,因此有必要开发反应条件温和、绿色无污染的生物合成路线。本文拟通过挖掘、改造亚胺还原酶以用于合成5-ID-PTOX。分析5-ID-PTOX的化学结构特征,其是在鬼臼毒素的C环4位上通过C-NH引入了5-氨基吲唑模块的手性胺类化合物,而手性胺类化合物的生物合成主要通过亚胺还原酶催化酮和胺的还原胺化产生,因此本文主要设计了以鬼臼毒酮和5-氨基吲唑为出发底物以亚胺还原酶为生物催化剂的生物合成路线,但通过对实验室前期已建立的含有222个亚胺还原酶的酶库进行筛选,发现酶库中的亚胺还原酶难以催化大模块芳基酮和芳基胺的还原胺化反应,倾向于将底物鬼臼毒酮以底物步移拆分的小体积底物的转化。为了获得有初始活性的酶,本研究以鬼臼毒酮和5-氨基吲唑为底物通过化学方法合成5-氨基吲唑鬼臼毒素亚胺中间体,再以5-氨基吲唑鬼臼毒素亚胺中间体为底物进行酶库的筛选,经过质谱鉴定,核磁鉴定,小分子晶体结构的解析,发现亚胺还原酶I16可以催化5-氨基吲唑鬼臼毒素亚胺中间体反应生成4α-NH-（5-氨基吲唑）-鬼臼毒素。为了获得酶I16和底物的共晶以用于对I16进行半理性设计以提高其活性,进行了蛋白晶体的培养筛选,获得了衍射率为6?的I16蛋白晶体,为后续解析I16以及I16和底物的复合物晶体结构奠定基础。运用Auto Duck Vina和Hot Spot Wizard进行分子对接和关键残基预测,对I16进行两轮的半理性设计,以5-氨基吲唑鬼臼毒素亚胺中间体为底物对第一轮构建的1023个I16变体及其第二轮构建的736个I16-M1变体的突变体文库进行筛选,筛选到最优变体I16-M2（I16-L180T/W215L/A219L/F223W）,其催化亚胺中间体还原的转化率由野生型的13.6%提升至41.0%。通过以上研究,本论文利用亚胺还原酶I16-M2建立了抗肿瘤候选药物4α-NH-（5-氨基吲唑）-鬼臼毒素的化学酶法合成路线,为建立5-ID-PTOX生物合成提供技术路线支持。
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