目前，临床上真菌性角膜炎早期诊断缓慢且缺乏有效的药物手术治疗方法，导致该病的医治过程非常棘手，而手术治疗存在术后出现并发症的可能性。随着各种基础和临床研究的日益深入，人们逐渐认识到，有的FK病程进展迅速，且往往迁延不愈，角膜感染的发生、发展过程中致病真菌被角膜上识别受体识别后引起的免疫反应以及炎症应答，在清除真菌的同时也可导致角膜组织的损伤，而真菌性角膜炎的最后转归主要取决于机体清除致病真菌的能力和致病菌种的毒力，其次是角膜炎症应答造成的侵害及修复愈合因素之间的均衡性相关。在FK感染过程中主要是中性粒细胞及单核巨噬细胞的浸润。巨噬细胞是炎症应答的必要组分，迅速招募到角膜基质，产生各种细胞因子，巨噬细胞清除真菌包括吞噬、溶酶体脱颗粒及杀菌，此过程中产生了氧化代谢产物并触发呼吸爆发反应。巨噬细胞吞噬和杀菌的同时产生金属蛋白酶、弹性蛋白酶胶原酶以及酸性水解酶等，这些溶酶体酶及氧自由基等能将吞噬的致病菌分解消灭但也可溶解角膜基质形成坏死脓肿。所以，适当的炎症应答调控对于真菌清除至关重要，如果炎症反应失控，持续和深层的炎症细胞浸润反而导致角膜结构破坏。浸润性的发生早期细胞凋亡和凋亡细胞的有效清除降低了炎症反应和组织损伤的副作用。　　众所周知，固有免疫反应是机体抵抗外来病原体入侵的第一道防线。机体遭受致病真菌侵袭后，首先通过模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs）非特异性识别真菌的一种或多种病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)，进而激活下游信号转导通路，引发炎性细胞吞噬作用以及炎症反应，继而诱导机体产生适应性免疫应答，彻底清除致病菌。角膜上皮细胞除作为天然免疫屏障外，还可表达多种PRRs，能有效识别致病真菌，分泌炎性细胞因子，参与FK固有免疫反应。常见的PAMPs主要包括脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、肽聚糖(peptidoglycan，PGN)、鞭毛蛋白以及一些微生物的核酸分子。这些PAMPs均能够被PRRs识别进而激活下游信号通路，引起炎症反应或者参与抗菌免疫应答。目前已发现的PRRs主要包括定位于细胞膜上的Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)和C型凝集素样受体(C-type lectin receptors，CLRs)以及定位于胞浆内的核苷酸结合寡聚域样受体(NOD like receptors，NLRs)和位于细胞质中的维甲酸诱导基因Ⅰ样受体(RIG-I like receptors，RLRs)等。其中，NLRs在抗真菌感染免疫中的作用已得到证实。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor protein3，NLRP3)是NLRs家族中重要的一员，是一种存在于巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cells，DCs)等胞质中的多蛋白复合物。病理条件下，NLRP3可以被细菌、真菌、病毒等的PAMP，以及高浓度ATP、尿酸晶体等的线粒体损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)所激活，启动NLRP3/凋亡相关样斑点样蛋白(apoptosis-associatedspeck-like protein containing a CARD，ASC)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前体（pro-cysteinyl aspartate-specific protease-1，pro-caspase-1）炎症复合体的组装，pro-caspase-1自身剪切活化成熟，并激活下游的白介素(interleukin，IL)-1β和IL-18，参与宿主固有免疫反应。然而，NLRP3炎症复合物及其下游细胞因子在角膜抗真菌感染中的作用和机制还不甚清楚。　　第一部分 NLRP3炎症小体在真菌性角膜炎患者的表达及意义　　目的：探究NLRP3炎症小体在真菌性角膜炎患者的表达及其临床意义　　方法：选取2017年6月到2018年6月于安徽省立医院医院确诊并行手术的真菌性角膜炎患者15例以及正常对照组15例，采用PAS染色明确病灶中菌丝含量以及免疫组化方法检测NLRP3炎症小体表达情况。　　结果：在临床确诊的真菌性角膜炎患者的病损角膜组织中，均可见明显的NLRP3炎性小体阳性染色，病灶中菌丝含量多及炎症浸润明显的NLRP3炎性小体的染色强度和范围明显增加，对照组未见明显NLRP3炎性小体阳性染色。　　结论：真菌感染的角膜溃疡可引起角膜NLRP3的活化。　　第二部分 NLRP3炎症小体在真菌角膜炎模型小鼠中的表达及意义　　目的：体内探索NLRP3炎症小体在真菌角膜炎模型小鼠中的表达及FK506对真菌性角膜炎的治疗效果　　方法：建立C57BL/6小鼠真菌性角膜炎感染模型，采用流式细胞仪和ELISA分别检测角膜中巨噬细胞特异性标志物F4/80的表达情况和炎症细胞因子的分泌情况;采用免疫组化方法和蛋白免疫印迹(western blot)法，检测NLRP3炎症小体及其下游炎症细胞因子在真菌性角膜炎模型小鼠中的表达情况;分别选取50只真菌性角膜炎模型小鼠，随机分为5组，每组10只，包括模型组、生理盐水治疗组、那他霉素治疗组、FK506治疗组、那他霉素-FK506联合治疗组。通过上述方法检测FK506对NLRP3炎症小体活化及炎症因子表达的影响。　　结果：与对照组角膜组织相比，C57BL/6小鼠角膜感染黄曲霉菌和茄病镰刀菌48h后，流式细胞术检测可见角膜区域出现较高比例的巨噬细胞;ELISA检测结果也显示C57BL/6小鼠角膜组织中IFN-γ、TNF-α、IL-6的表达水显著升高;HE染色结果可见，C57BL/6小鼠角膜组织结构破坏明显，角膜显著水肿观察增厚，有典型的内皮斑块形成，斑块内部形成坏死区域和微血管;免疫组织化学结果显示:真菌感染后小鼠角膜组织中可见明显的NLRP3炎性小体阳性染色，且茄病镰刀菌感染组织中NLRP3炎性小体的染色强度和范围明显高于黄曲霉菌感染组织;Western blot结果显示:真菌感染后NLRP3炎性小体、ASC、procaspase-1(p45)、cleaved caspase-1(p10)、pro-IL-1β、IL-1β、IL-18等的蛋白表达水平明显升高;给予FK506、那他霉素单方和联合治疗后，炎性反应和角膜水肿状况得到了极大的缓解，NLRP3、ASC、p45、p10、pro-IL-1β、IL-1β、IL-18蛋白表达水平显著降低，且与单独给药相比，FK506联合那他霉素治疗作用更显著。　　结论：C57BL/6小鼠角膜真菌感染后角膜组织中巨噬细胞大量聚集、炎性细胞因子分泌量也显著升高;NLRP3、ASC、p45、p10、pro-IL-1β、IL-1β、IL-18等的蛋白表达水平显著提高;FK506联合那他霉素可显著减轻黄曲霉菌或茄病镰刀菌引起的角膜NLRP3炎症因子的活化作用。　　第三部分 黄曲霉菌、茄病镰刀菌活化NLRP3的机制研究　　目的：体外探究黄曲霉菌、茄病镰刀菌活化NLRP3的机制　　方法：体外培养并诱导分化的THP-1巨噬细胞与黄曲霉菌或茄病镰刀菌共培养，建立黄曲霉菌或茄病镰刀菌感染的体外巨噬细胞模型，并分别以磷酸盐缓冲液(phosphate Buffer solution，PBS)、LPS刺激为阴性和阳性对照，于真菌刺激6h后，收集细胞和上清液，采用western blot检测NLRP3、ACS、Caspases-1p10、Caspases-1p45、pro-IL-1β、IL-1β和IL-18的蛋白表达水平;ELISA检测上清中IL-1β和IL-18的分泌量;并评价巨噬细胞对真菌的吞噬能力。将佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)诱导分化的THP-1巨噬细胞，分别转染空载体阴性对照(NC siRNA)、NLRP3特异性小干扰质粒(siRNA)、ACS siRNA、caspase-1siRNA，分别用黄曲霉菌或茄病镰刀菌感染刺激6h后，收集细胞和上清液，实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测各干扰表达组转染效率;采用ELISA检测上清中IL-1β、IL-18、干扰素(interferon，IFN)-γ、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-6的分泌量。　　结果：与对照组相比，LPS刺激或真菌感染后，THP-1巨噬细胞中ASC，NLRP3，Caspase-1p10、p45，Pro-IL-1β，IL-1β，IL-18蛋白表达水平显著升高;IL-1β和IL-18分泌量也显著增多;活化的THP-1巨噬细胞能有效吞噬40％以上的黄曲霉菌和茄病镰刀菌。与NC siRNA转染组相比，各干扰表达组THP-1巨噬细胞中IL-1β、IL-18、IFN-γ、TNF-α、IL-6的表达水平均显著降低;其中，NLRP3干扰表达组降低最显著。　　结论：LPS或真菌刺激可活化NLRP3炎症复合物;NLRP3炎性小体通路的激活可诱导巨噬细胞分泌下游相关细胞因子IL-1β、IL-18炎症因子。通过抑制NLRP3炎性小体的活化达到控制炎症的目的。