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胸腺素al(Thymosin alpha l,Tal)是由28个氨基酸组成的酸性多肽,作为免疫增强剂,其除具有免疫刺激效应外,还具有抗病毒及抗肿瘤功能。目前,其广泛应用于非小细胞性肺癌、病毒性肝炎及免疫缺陷等重大疾病的临床治疗。其分子量很小,只有3108D,故利用基因工程获取Tal单体显得很困难。迄今,已有若干研究报道将Tal基因与具有特定生物学功能的效应分子进行融合表达,如与谷胱甘肽、硫氧还蛋白及干扰素α-2b等的融合,均取得较高效的表达结果。 抗肺癌单链抗体(LC-1 single-chain Fv,LC-1 ScFv)是对抗肺癌杂交瘤细胞株(LC-1)分泌的单克隆抗体进行基因改造而获得的,是具有与抗原结合能力的最小抗体片段。在抗体分子上连接细胞毒素、细胞因子或破坏细胞结构的酶、药物及放射性同性素,可构建对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用的复合物,后者统称为免疫毒素或生物导弹。免疫毒素在早期肿瘤的诊断、治疗中具有重要作用,同时也是手术、化疗后晚期癌症的有效治疗手段之一。有人将肿瘤坏死因子、绿脓杆菌外毒素、白喉毒素与ScFv连接,用于肿瘤的导向治疗。本实验首次将完整的抗肺癌单链抗体重组基因与Tal基因偶联,进行融合表达。获得表达的双功能蛋白具有抗体的靶向性及Tal的活性,既克服了Tal表达困难的缺点,又能借助ScFv直达病灶的特性获得良好的治疗效果,为肺癌的治疗及检测探索了新途径。 本实验从高分泌量和活力较高的抗肺癌杂交瘤单克隆细胞株抽提总RNA,并反转录成cDNA。设计引物,利用PCR获得单链抗体的重链和轻链基因,克隆到pUCm-T载体并测序。利用重叠延伸PCR法将重链和轻链基因构建为单链抗体形式。修饰后的单链抗体与pET-22b(+)质粒连接,构建质粒pET22-ScFv。同时,以重组质粒pET39-Tal为模板,PCR获得Tal基因,连接到pUCm-T载体上。对质粒pET22-ScFv、pLJCm-T-Tal双酶切,回收相应片段,将Tal连接到ScFv的C端,构建ScFv-Tal重组体,并转化大肠杆菌BL2l,进行融合表达。在最佳表达条件(30℃,IPTG浓度0.5mmol/L,诱导表达5h)下,外源基因产物表达量占全菌蛋白的30%左右。