【摘 要】
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异戊二烯是合成橡胶工业生产的重要来源,采用微生物发酵法,经由甲羟戊酸（MVA）途径合成异戊二烯是一种绿色、可持续的方法,受到越来越多的关注和研究。基于微生物细胞策略合成异戊二烯面临着一个主要问题:有毒中间体的产生或营养物质的限制可能影响目标产物的产量和细胞生长,且胞内反应复杂不可控,限制了其在合成异戊二烯方面的发展。对发酵法生产异戊二烯进行外场强化,打破目前单独采用发酵法存在的产量低等瓶颈问题,是
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异戊二烯是合成橡胶工业生产的重要来源,采用微生物发酵法,经由甲羟戊酸（MVA）途径合成异戊二烯是一种绿色、可持续的方法,受到越来越多的关注和研究。基于微生物细胞策略合成异戊二烯面临着一个主要问题:有毒中间体的产生或营养物质的限制可能影响目标产物的产量和细胞生长,且胞内反应复杂不可控,限制了其在合成异戊二烯方面的发展。对发酵法生产异戊二烯进行外场强化,打破目前单独采用发酵法存在的产量低等瓶颈问题,是促进发酵法生产异戊二烯的关键。本论文培养了已构建好的含MVA下游途径五种蛋白的大肠杆菌重组菌,经诱导表达、破碎收取、纯化超滤等步骤获得了游离形式的纯酶。以介孔分子筛SBA-15为载体,采用吸附、吸附-交联耦合两种固定化方法将MVA下游五种关键酶进行固定化,通过对五种酶配比的调控和固定化方法的考察,制得高稳高活性固定化酶SBA-15-R和PEGDGE-SBA-15-R,并考察了p H、温度、交联剂、交联剂浓度、交联时间等条件的影响,得到了最佳生产工艺条件。在最佳的生产工艺条件下,固定化酶催化MVA合成异戊二烯产量均可达200 mg/L以上,其中PEGDGE-SBA-15-五酶催化产量可达453 mg/L,显著高于游离酶的191 mg/L。此外,固定化酶还具有优异的储存稳定性和重复使用性,SBA-15-R和PEGDGE-SBA-15-R在室温条件下储存30天后分别保留50%和80%以上的活性,在连续操作使用5次后分别保留37%和83%以上的活性。本实验通过吸附-交联耦合的固定化酶方法实现该五种酶的体外高效级联反应和回收利用,为构建固定化酶—发酵协同反应体系,解决单独采用生物发酵生产异戊二烯过程中产率低的问题提供技术储备。
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