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精对苯二甲酸(PTA)和合成制药废水中,含有持久性有机污染物(POPs)以及环境内分泌干扰物(EDCs),可产生分子毒性,引发环境疾病。应用普通的废水生物处理法,不能彻底废水中的POPs和EDCs,出水不能达标排放。为了去除废水中的POPs以及ECDs的毒性成分,本课题应用跨界原生质体融合技术(IKPF),构建出了高效降解PTA和制药废水POPs的功能菌株Fhhh和Xhhh,分别在2004年和2003年的现场工程中证实。它们均是由真核微生物(PC和SC)与原核微生物(YZ或XZ)两界细胞的3个亲株原生质体,跨界融合构建而成的基因工程菌。本文主要报道融合子基因组DNA分子鉴定的结果。
研究中(1)应用扫描电镜(SEM)初步鉴定Fhhh和Xhhh的细胞形态;(2)应用抗药性标记,进行细胞生化特征鉴定;(3)应用随机扩增多态性DNA技术(RAPD),分析基因组分子指纹,构建遗传图谱以及研究融合子与亲株间亲缘关系;(4)应用目标功能基因PCR技术,分析功能基因PCR产物,获取Fhhh和Xhhh融合后的分子生物学依据。研究结果如下:
(1)Fhhh、Xhhh的细胞形状、细胞尺寸,都与其三亲株存在着显著的差异;
(2)Fhhh、Xhhh均从真核和原核亲本细胞获得了对链霉素和对制霉菌素的抗性;
(3)应用筛选出的38条引物,通过随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,扩增出了Fhhh、Xhhh及其三亲株的RAPD基因组分子指纹。借助Quatlity One以及NTsys_2.0软件进行了聚类分析,结果显示Fhhh与PC、SC与YZ的遗传相似指数S1分别为34.01%、33.16%和35.97%,Xhhh与PC、SC与XZ的遗传相似指数S1分别为36.21%、37.73%和37.48%,指示出融合子与三亲株间存在明显的亲缘关系并且从三亲株获得了大致相等的遗传信息;
(4)根据已公布的mnp、lip核酸序列设计引物,自融合子Fhhh、Xhhh及其亲株PC中扩增出了mnp、lip功能基因片段并对其进行了序列测定,证明了Fhhh、Xhhh从PC遗传了高降解性基因。
研究结果表明,综合应用随机扩增多态性DNA技术和目标功能基因PCR扩增技术,可以快速准确的用于跨界原生质体融合菌株的遗传特征分子鉴定;SEM细胞形态学与双抗生素的生化鉴定,是早期筛选鉴定跨界原生质体融合子的有效方法。融合子鉴定技术,已经深入到分子生物学及生物信息学的水平。本项研究,探索了鉴定跨界融合菌株的基因组分子遗传学技术。