论文部分内容阅读
第一部分下调HSP27对AS-TM细胞增殖、凋亡的影响目的:本实验将利用基因沉默技术来研究HSP27对砷致HaCaT恶性表型细胞(AS-TM细胞)的影响。方法:1.将HaCaT细胞培养于含砷浓度为100nM/L的完全培养基中,180天后收集制备AS-TM细胞。2.逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)检测HaCaT细胞和AS-TM细胞中HSP27的mRNA表达水平。3.实验细胞随机分成三组,分别是:利用lip2000技术分别将HSP27抑制物、阴性对照转染至AS-TM细胞中的HSP27 inhibitors组、inhibitors NC组;不做转染的空白对照组即control组。4.蛋白质印记技术(Western-blot)检测三组AS-TM细胞转染24小时后HSP27的蛋白表达水平。5.RT—PCR技术检测三组AS-TM细胞转染24小时后HSP27的mRNA表达水平。6.采用CCK8法检测三组AS-TM细胞转染48小时后的增殖能力。7.利用流式细胞仪检测三组AS-TM细胞转染48小时后的调亡情况。结果:1.RT-PCR检测结果显示HSP27在AS-TM细胞中的表达明显高于HaCaT细胞(P<0.05)。2.HSP27 inhibitors组中HSP27的蛋白表达量低于空白组及其阴性对照组(inhibitors NC组)(P<0.05);空白组与阴性对照组相比无明显差异。3.HSP27 inhibitors组中mRNA表达量低于空白组及其阴性对照组(inhibitors NC组)(P<0.05);空白组与阴性对照组相比无明显差异。4.CCK8法检测结果显示,HSP27 inhibitors组中AS-TM细胞的增殖能力低于空白组及其阴性对照组(P<0.05),阴性对照组和空白组相比,AS-TM细胞增殖能力无明显差异(P>0.05)。5.流式细胞仪检测细胞凋亡率结果显示:HSP27 inhibitors组(36.17%±13.07%)、inhibitors NC组(8.83%±4.59%)、control组(8.4%±3.64%),HSP27 inhibitors组中AS-TM细胞的调亡率高于空白对照组及其阴性对照组(P<0.05),阴性对照组和空白组相比,其细胞调亡率无明显差异(P>0.05)。结论:1.砷致HaCaT恶性表型细胞(AS-TM细胞)中HSP27的表达明显高于HaCaT细胞。2.沉默HSP27可抑制AS-TM细胞的增殖能力同时促进其凋亡。3.HSP27在砷致HaCaT恶性转化中可能扮演着类似促癌基因的角色。可以考虑将其作为砷致皮肤癌诊断和治疗的新靶点。第二部分姜黄素对AS-TM细胞增殖的影响目的:利用砷诱导人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)180天,制成砷致HaCaT恶性表型细胞(AS-TM细胞)来模拟砷致皮肤癌。分别将不同浓度的姜黄素对AS-TM细胞进行培养24小时、48小时,来观察姜黄素不同给药浓度、不同给药时间对AS-TM细胞增殖的影响。方法:1.将HaCaT细胞培养于含砷浓度为100nM/L的完全培养基中180天制备制成砷致HaCaT恶性表型细胞(AS-TM细胞)。2.将姜黄素按20mg/ml的浓度溶于DMSO中,后续按实验所需浓度加完全培养基梯度稀释成40umol/L、30umol/L、20umol/L、10umol/L、0umol/L。3、姜黄素处理AS-TM细胞24小时、48小时后运用CCK8检测AS-TM细胞的增殖情况。结果:1、同一时间段姜黄素对AS-TM细胞增殖的抑制能力随着姜黄素浓度增加而增加,且加药组的细胞增殖能力都明显低于对照组(P<0.01)。2、同一浓度的姜黄素48小时时对AS-TM细胞增殖的抑制能力高于24小时,且加药组的细胞增殖能力都明显低于对照组(P<0.05)。结论:1.本实验成功建立了砷致HaCaT恶性表型细胞(AS-TM细胞)模型。2.姜黄素可以抑制AS-TM细胞的增殖,这种抑制作用具有剂量和时间依赖性。