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乳腺癌是女性恶性肿瘤中的一种常见性肿瘤,对女性身心健康形成严重威胁。2012年相关数据显示,全球女性罹患各种恶性肿瘤中,乳腺癌新增率、死亡率全部排名第一位。从国内来看,我国女性乳腺癌的发病率年均增幅达2.5%,发病人数和增长速度均位于世界前列。在过去的几十年中,尽管乳腺癌的诊断和治疗水平均有较大改善,但肿瘤的复发和远处转移仍是威胁患者生命的重要因素。因此,从分子水平对乳腺癌复发、转移机制进行进一步探讨,明确与之相关的调控机制,对进一步改善患者的预后将具有重要意义。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是指肿瘤组织中少数具有自我更新和无限增殖潜能的细胞,与肿瘤的形成和发育密切相关。目前认为,传统治疗技术无法有效杀灭CSCs,而仅可将肿瘤内非干细胞成分消灭,从而导致肿瘤复发转移。因此,将CSCs当成靶点的治疗模式具有较大的临床应用空间与发展潜力。目前,尽管数量众多的CSCs标记物已被识别,而基于CSCs的靶向治疗依然缺乏。因此,迫切需要找到特异性的肿瘤干细胞分子标记物及调控途径为肿瘤的治疗提供新的方式。NRP-1(Neuropilin-1,神经纤维蛋白1)隶属于Neuropilin(神经纤毛蛋白)家族成员,最初在神经系统内被发现。到如今,研究结果证实,神经纤维蛋白1可以影响肿瘤的形成、变化、增殖、迁移、凋亡及肿瘤病人预后。NRP-1能够与多种配体结合,增强多种生长因子的效应,影响肿瘤侵袭转移、血管生成、神经发育等。目前越来越多的研究证实NRP-1为VEGF-A的共同受体,其主要通过促进VEGF亚型与其受体结合及形成NRP-1/VEGF/VEGFR1/2复合体等等途径来促进新血管产生、肿瘤细胞增殖并导致肿瘤迁移。在乳腺癌发病机制研究领域内,NRP-1的相关研究近年来成为学者关注的一个热点。NRP-1会影响乳腺癌细胞的增殖,凋亡,迁移,侵袭等生物学行为。但是,目前尚无NRP-1在影响乳腺癌干细胞特性中的作用及相关调控机制的研究。本研究以过表达及基因沉默技术为依据,观察NRP-1对乳腺癌细胞干细胞特性的影响。进一步研究了 NRP-1与参与肿瘤干细胞调控的重信号通路Wnt/β-catenin的关系。同时探讨了miR-376a对NRP-1的调控作用以及对乳腺癌细胞干细胞特性的影响。本研究旨在探究NRP-1在影响乳腺癌干细胞特性中的作用及相关调控机制,意在进一步探索以乳腺癌干细胞为目标的靶向治疗模式。研究共分三大章节。第一章:NRP-1在促进乳腺癌细胞干细胞特性中的作用。第二章:NRP-1促进乳腺癌细胞干细胞特性的机制研究。第三章:乳腺癌细胞中NRP-1的相关调控机制。第一章:NRP-1在促进乳腺癌细胞干细胞特性中的作用目的:肿瘤干细胞理论提示靶向肿瘤干细胞治疗是一种很有前途的抗肿瘤方法。我们前期的研究表明,NRP-1可以促进乳腺癌细胞增殖及侵袭,同时发现,过表达NRP-1可促进乳腺癌微球体形成,但相关机制未明确。基于此,我们进一步在肿瘤干细胞特性方面研究NRP-1对乳腺癌细胞的影响,为基于NRP-1为靶点的靶向乳腺癌干细胞治疗提供理论依据。方法:1.在MCF-7细胞中过表达NRP-1,在MDA-MB-231细胞中干扰NRP-1;通过细胞球形成实验,检测细胞成球能力的变化;Western blot及qRT-PCR检测OCT4和Nanog的表达水平;异种移植小鼠,检测干扰或过表达NRP-1对乳腺癌细胞小鼠体内成瘤性的影响,检测移植瘤组织中血管标记物CD34表达情况。2.采用悬浮培养法获得乳腺癌细胞球,qRT-PCR检测乳腺癌细胞球细胞和亲本细胞中NRP-1和肿瘤干细胞标志物CD44和ALDH1的表达情况。检测细胞球细胞及亲本细胞的小鼠体内成瘤性,并取移植瘤组织做免疫组化检测CD34表达情况。3.qRT-PCR检测多柔比星耐药细胞组株(MCF-7-Adr)和非耐药株MCF-7中NRP-1的表达水平,成球实验检测MCF-7-Adr和MCF-7细胞体外成球能力,利用流式细胞仪对CD44+/CD24·细胞亚群在MCF-7-Adr和MCF-7中的占比进行分析。4.流式细胞仪凋亡分析和Western blot实验检测过表达NRP-1对多柔比星耐药性的影响。CCK-8法检测沉默NRP-1基因对MCF-7-Adr细胞多柔比星耐药性的影响。结果:1.MCF-7细胞NRP-1过表达组与其对照组相比,细胞成球能力强,OCT4和Nanog均有较高的表达水平,裸鼠体内成瘤性增强,移植瘤组织中CD34阳性细胞比例增高。与此相反,MDA-MB-231细胞NRP-1干扰组与其对照相比细胞成球能力弱,OCT4和Nanog的表达水平降低,细胞体内成瘤性减弱,移植瘤组织中CD34阳性细胞比例降低。2.qRT-PCR测试结果证实,细胞球细胞NRP-1及肿瘤干细胞标志物CD44和ALDH1的表达高于亲本细胞。小鼠异种移植模型结果表明,细胞球细胞的小鼠体内成瘤性明显强于亲本细胞,并且其形成的移植瘤组织中CD34阳性细胞比例明显增高。3.qRT-PCR检测多柔比星耐药细胞株MCF-7-Adr中NRP-1的表达水平高于非耐药株MCF-7,体外成球实验发现MCF-7-Adr的成球能力要高于非耐药株,流式细胞仪结果显示,和MCF-7细胞相比MCF-7-Adr内含有更多的CD44+/CD24-细胞亚群。4.CCK-8及流式细胞仪凋亡分析结果发现NRP-1基因敲除后,MCF-7-Adr细胞对多柔比星的耐药性得到逆转。结论:1.NRP-1可促进乳腺癌细胞干细胞特性。2.NRP-1可以调控乳腺癌细胞多柔比星耐药,与其维持干细胞特性有关。第二章:NRP-1增强乳腺癌细胞干细胞特性的机制研究目的:检测乳腺癌细胞中NRP-1与VEGF-A相互作用关系以及对Wnt/β-catenin通路的调节作用,旨在探讨NRP-1促进乳腺癌干细胞特性的相关机制。方法:1.利用Western blot和qRT-PCR对乳腺癌亲本细胞与细胞球细胞中NRP-1与VEGF-A的蛋白、mRNA表达水平进行检测,免疫共沉淀(IP)检测乳腺癌细胞球细胞中VEGF-A是否可以和NRP-1直接相互作用。2.细胞球形成实验、软琼脂克隆形成实验、Transwell实验和异种移植实验检测NRP-1抑制剂(EG00229)对乳腺癌细胞干细胞特性的影响。3.过表达NRP-1或干扰NRP-1后,采用Western blot和qRT-PCR检测乳腺癌细胞中β-catenin与Wnt3a表达水平的变化。4.Transwell实验、细胞球形成实验检测Wnt/β-catenin通路抑制剂Wnt-C59对乳腺癌细胞干细胞特性的影响。结果:1.Western blot及qRT-PCR检测结果表明乳腺癌细胞球中VEGF-A和NRP-1的表达水平明显高于亲本细胞,免疫共沉淀(IP)检测结果证实乳腺癌细胞球中VEGF-A与NRP-1二者可以直接相互作用。2.体外成球实验、软琼脂克隆形成实验、Transwell实验和异种移植实验结果提示VEGF-A/NRP-1通路抑制剂(EG00229)可以使乳腺癌细胞干细胞特性减弱。3.Western blot及qRT-PCR结果显示MCF-7细胞NRP-1过表达组与对照组相比,β-catenin与Wnt3a表达水平升高;MDA-MB-231细胞NRP-1干扰组与对照组相比,β-catenin与Wnt3a表达水平下降。4.体外成球实验、CD44+/CD24-细胞比例测定及Transwell实验提示Wnt-C59可以减弱乳腺癌细胞的干细胞特性。结论:1.NRP-1通过与VEGF-A结合影响乳腺癌细胞干细胞特性。2.NRP-1通过下游信号通路Wnt/ββ-catenin调节乳腺癌细胞干细胞特性。第三章:乳腺癌细胞中NRP-1的相关调控机制目的:通过miRNA.org数据库查找可能调节NRP-1的microRNA并进行功能实验验证,探讨乳腺癌细胞中NRP-1的相关调控机制。方法:1.通过计算机软件预测乳腺癌细胞中可能靶向调控NRP-1的microRNA2.Western blot及qRT-PCR实验检测在乳腺癌细胞中过表达miR-376a对NRP-1表达的影响。3.荧光素酶报告实验验证miR-376a是否能靶向调控NRP-1 mRNA的表达。4.Western blot实验检测过表达miR-376a对乳腺癌细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白wnt3a和β-catenin的影响。5.CCK-8实验、流式凋亡分析、Western blot和Transwell实验检测miR-376a对乳腺癌细胞增殖、迁移、EMT及干细胞特性的影响6.转染LV-NRP-1或经Wnt/β-catenin激动剂SKL2001处理后对过表达miR-376a的乳腺癌细胞增殖、迁移、EMT及干细胞特性的影响。结果:1.计算机软件预测乳腺癌细胞中miR-376a可能调控NRP-1 mRNA。2.Western blot及qRT-PCR实验表明miR-376a过表达可以抑制乳腺癌细胞NRP-1表达。3.荧光素酶报告实验结果证实乳腺癌细胞中miR-376a可以直接靶向调控NRP-1。4.Western blot实验结果提示在MDA-MB-453和MDA-MB-231细胞中转染LV-miR-376a,可导致wnt3a和β-catenin的蛋白表达水平降低。5.CCK-8实验、流式细胞仪凋亡分析、Western blot和Transwell实验发现miR-376a可抑制乳腺癌细胞增殖、迁移、EMT及干细胞特性。6.过表达NRP-1或应用β-catenin激动剂SKL2001可以逆转miR-376a对乳腺癌细胞增殖、迁移、EMT及干细胞特性的抑制作用。结论:1.乳腺癌细胞中NRP-1是miR-376a的调控靶基因。2.miR-376a靶向调控NRP-1影响乳腺癌细胞增殖、迁移、EMT及干细胞特性。