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兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)是兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)的病原,是杯状病毒科兔病毒属成员,VP60是RHDV的主要结构蛋白。研究证实,RHDV与同属于杯状病毒科的诺如病毒一样,能够结合组织血型抗原(Histo-blood group antigens,HBGAs),促进感染的发生。杆状病毒表达的重组VP60蛋白能够自聚成病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)。为探索RHDV与宿主间相互作用的机制,本论文建立了 RHDV VP60蛋白结合HBGAs的酶联免疫方法,能够定性地检测VP60蛋白与HBGAs的结合能力;利用RHDV VP60蛋白P2亚区(287-449aa)的截短表达蛋白,分析其与受体HBGAs的结合特性,初步探索RHDV与HBGAs的结合位点;通过对VP60蛋白的411-417aa和502-510aa进行突变,构建了两个VP60嵌合体,研究这两个位点与RHDV血凝特性以及结合HBGAs能力的相关性。主要研究内容如下:1 VP60蛋白结合HBGAs蘇联免疫方法的建立通过血凝抑制试验筛选含H型HBGAs的唾液样品,采用正交连续稀释法确定结合试验的包被条件、唾液最适稀释度、VP60蛋白浓度、一抗3D11最佳稀释度以及酶标二抗最佳稀释度,建立RHDV衣壳蛋白VP60与唾液中HBGAs受体结合的酶联免疫方法。参照上述反应条件,通过筛选VP60蛋白结合H2型合成多糖的最适稀释液和最适反应温度,建立RHDV VP60蛋白与H2型合成多糖结合的酶联免疫方法,用于定性分析衣壳蛋白VP60与HBGAs的结合。2 VP60蛋白P2亚区的截短表达及其与受体HBGAs结合位点的初步分析针对RHDV VP60蛋白P2亚区(287-449aa)设计截短表达蛋白片段,构建原核表达载体 pET32a(+)-250-350、pET32a(+)-330-449、pET32a(+)-330-350、pET32a(+)-330-345和pET32a(+)-335-350,采用大肠杆菌DE3表达系统表达截短蛋白P250-350、P330-449、P330-350、P330-345、P335-350,并通过蛋白质电泳和免疫印迹分析鉴定。利用RHDVVP60蛋白的唾液结合试验以及合成多糖结合试验方法,检测P2亚区截短表达蛋白与HBGAs的结合能力。结果表明,两种酶联免疫方法的检测结果一致,P2 亚区截短表达蛋白 P250-350、P330-449、P330-350、P330-345、P335-350均能够与HBGAs强烈结合。这表明VP60蛋白P2亚区能够结合HBGAs,依此推测,RHDV VP60蛋白与HBGAs的结合位点位于335-345aa处。3 VP60嵌合蛋白的表达及血凝j性分析针对RHDV VP60蛋白的411-417aa、502-510aa分别设计引物,通过SOE法将411-417aa和502-510aa等量替换成linker序列GSGGSGG、GGSGGGSGG,构建真核表达载体 pFastBacTM 1-VP60-M-1、pFastBacTM 1-VP60-M-2,获得重组穿梭载体Bacmid-M-1、Bacmid-M-2,利用杆状病毒表达系统表达VP60嵌合蛋白P411-417和P502-510。通过间接免疫荧光检测、蛋白质电泳和免疫印迹等方法鉴定嵌合蛋白。通过负染透射电镜观察嵌合蛋白VLPs的形成,利用血凝试验、RHDV VP60的唾液结合试验及合成多糖结合试验等检测方法分析嵌合蛋白的特性变化。结果显示,411-417aa的替换不影响嵌合蛋白VLPs的形成,嵌合蛋白仍然能够结合HBGAs,但其血凝特性消失;嵌合蛋白P502-510未能形成清晰完整的VLPs,血凝性消失,不能结合HBGAs。这表明411-417aa和502-510aa能够显著影响RHDV的血凝特性,502-510aa可能对RHDV完整VLPs的形成具有重要意义,而VLPs的形成与否也可能影响VP60结合HBGAs的能力。VP60蛋白与HBGAs结合区域的初步定位和VP60嵌合蛋白血凝特性及其与HBGAs结合能力的初步研究,有助于阐明RHDV与宿主的相互作用机制,为揭示RHDV的致病机理奠定了基础。