细胞色素P450酶活性评价的体外“cocktail”高通量筛选模型的建立和应用

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细胞色素P450(CYPs)为存在于肝脏微粒体混合功能氧化酶系的主要成分,是一组由许多同工酶组成的超基因大家族,对许多内源、外源性化合物在体内的Ⅰ相生物转化有重要作用。其中6种重要的CYPs亚型:CYP1A2(占总CYP药物代谢的4﹪)、CYP2C9(10﹪)、CYP2C19(2﹪)、CYP2D6(30﹪)、CYP2E1(2﹪)、CYP3A4(50﹪)参与了90﹪的临床药物的代谢。临床上两种或两种以上的药物同时或前后序贯用药时,在代谢环节产生作用的干扰,结果使疗效增强甚至产生毒副作用,或疗效减弱甚至失败。这种代谢性药物相互作用96﹪是由CYPs介导的, 其中酶抑制引起的药物相互作用约占全部的70﹪,酶诱导引起的占23﹪,其他类型占7﹪。所以在新药的研发过程中,确定哪些CYPs亚型参与了先导候选药的代谢,以及药物对CYPs的影响(诱导或抑制)是十分重要的一个步骤,这些信息能够帮助预测药物临床使用时的药物相互作用。研究药物的相互作用的方法有体外方法、体内方法,计算机模拟方法。作为早期的筛选研究,体外方法显得尤为重要,最常用的模型是利用人肝微粒体,评价药物对探针代谢情况的影响。 传统的方法在评价药物的抑制作用时,一次只能评价一种亚型。如果要完成上述6个主要亚型的研究,将是一个费时、费力、费钱的大工程。随着组合化学技术的发展,大量的先导化合物被开发出来,要完成这些物质的早期测评,传统的方法显然不能满足要求,这就需要建立可信、便捷的高通量筛选的方法。因此人们尝试同时给予多种探针药物,即“cocktail”法,来获取多个代谢酶的表型信息。“Pittsburgh cocktail”、“Cooperstown cocktail”、“Greenford-Ware cocktail”等是经典的 in vivo“cocktail”方法。近年来,Samuel等、Zhang等、Bu等、Unger等、Dierks等都分别独立建立了各自的体外cocktail方法:在人肝微粒体中,同时孵育探针的混合物,然后定量分析这些探针的代谢物的生成情况,以此来反映药物对CYPs的影响。体外cocktail方法的成功,很大程度上也依赖于能够快速、同时检测这些代谢物的分析方法。而现代的液质联用(LC/MS/MS)技术,以其高度的敏感性和选择性是满足上述要求的不二人选。 近年来,中药以其独特的疗效、不良反应少等优点,在世界特别是欧美国家的应用越来越广泛。中药和处方药合用的现象也更加普遍,因此使得中药-药物之间相互作用的几率也增大,如丹参、大蒜、银杏、枸杞子、木瓜、芒果能增加抗凝药华法林的效应,而酸果蔓汁、绿茶、大豆、圣约翰草则能降低它的抗凝效果;由此引发的胃肠道和心包出血所造成的死亡案例也有报道。这些相互作用不良反应中,尤其是中药对细胞色素P450酶的影响所造成的占了很大的比例。应用各种方法,已经证明许多中药的活性成分是CYPs的底物、抑制剂或诱导剂。 在中药的现代化进程中,对活性成分即单体的研究、开发和利用是重要的方面。但面对成千上万种中药单体,必须建立一种高通量筛选的方法,也就是上述的cocktail方法,来研究它们对CYPs的影响从而预测可能存在的药物相互作用。 虽然西方的大型制药公司已经广泛的应用cocktail方法来对大量的先导化合物进行体外抑制筛选,但对于我国的中药单体的高通量筛选工作至今未见报道。所以本课题的目的是要建立自己的“cocktai”1方法,并对多种萜类、黄酮类中药单体进行体外抑制筛选,并对有阳性结果的代表性中药单体进行体内试验。总共分为以下五个部分。 第一部分 人肝微粒体中6种探针代谢物的LC/MS/MS分析方法的建立 目的:建立人肝微粒体中扑热息痛、4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑、氧去甲基右美沙芬、6-羟基氯唑沙宗、氧化硝苯地平以及内标检测的质谱方法、液相方法及血浆样本的萃取方法。 结论:建立了LC/MS/MS方法检测人肝微粒体中扑热息痛、4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑、氧去甲基右美沙芬、6-羟基氯唑沙宗、氧化硝苯地平以及内标的浓度,方法精密度、准确度好,灵敏度高,适用于后续研究。 第二部分 人肝微粒体体外“COCktail”模型的建立与验证 目的:建立人肝微粒体的体外孵育体系;比较探针在“individual”和“cocktail”模型中的各种代谢行为,以验证“cocktail”模型的准确可行。 结论:建立了优化的人肝微粒体的体外孵育体系;探针在在“individual”和“cocktail”模型中的酶动力学参数相近,特异性抑制剂在“individual”和“cocktail”模型中IC<,50>值也相似,证明“cocktail”模型准确可行,为后续的中药单体高通量筛选奠定了基础。 第三部分 应用体外“cocktail”模型进行萜类中药单体的高通量抑制筛选 目的:应用体外“cocktail”模型第对20种萜类中药单体进行筛选,分析它们对CYPs各个亚型的抑制作用。对于阳性结果进行后续试验。 结论:体外cocktail法被成功的用于对20种萜类中药单体的筛选,筛选出了丹参酮ⅡA、隐丹参酮、青蒿素、甘草次酸这四种体外抑制能力比较强的萜类中药单体,提示有可能会引起药物的相互作用,需要进一步的体内试验来验证。“二步法”筛选策略也被证实是一个可靠,高效的方法。 第四部分 应用体外“COCktail”模型进行黄酮类中药单体的高通量抑制筛选 目的:应用体外“cocktail”模型对32种不同类别的黄酮类中药单体进行筛选,明确它们对CYPs各个亚型的抑制作用。对于阳性结果进行后续试验。方 结论: 1. 黄酮类中药单体对CYPs各个亚型普遍存在着不同程度的抑制,提示有可能会引起药物的相互作用,需要进一步的体内试验来验证。 2. 黄酮类化合物抑制CYP1A2的能力和结构之间存在明显的构效关系,和黄酮类的生物活性也存在类似关系,可以为新化合物的设计提供思路。 第五部分 丹参酮ⅡA、槲皮素、山萘酚、芦丁对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶的基因表达、蛋白表达和活性的影响 目的:考察丹参酮ⅡA、槲皮素、山萘酚、芦丁对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶的基因表达、蛋白表达和酶活性的影响 结论:丹参酮ⅡA、槲皮素、山萘酚、芦丁主要诱导了CYP1A2的基因和蛋白表达以及活性,而且呈现剂量依赖性。间或对其他亚型有影响,但不明显。提示与主要经由CYP1A2代谢的药物合用时,有可能发生相互作用。
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