胆管癌是一种来源于胆管上皮细胞的侵袭性肝肿瘤,早期在临床上通常无症状,或症状呈现非特异性。由于诊断一般较晚,且多存在多发疾病或年龄较高,近一半的胆管癌患者只能采用姑息疗法。放射治疗在胆管癌姑息治疗中占有重要地位。对于采用手术治疗的患者,术后辅助放射治疗也有着积极的意义。然而,无论采取哪种治疗方案,胆管癌仍易发生血管及远处淋巴结侵袭转移,引起癌症相关性死亡。有报道指出,放射治疗可能存在促进肿瘤转移的风险。因此,与放射处理相关的肿瘤转移机制可能参与胆管癌细胞的侵袭转移过程,其中血小板和粒细胞相关蛋白8(S100 calcium-binding protein A8,S100A8)在胆管癌转移中的潜在作用开始引起我们的关注。一方面,大量的研究表明,肿瘤细胞与血小板在血流微环境中的相互作用是肿瘤早期发生远处转移的必然因素。对肺癌、胰腺癌及乳腺癌等疾病的研究已经证实,血小板与肿瘤细胞间的相互作用使血小板活化,促使其分泌的多种细胞因子能够对肿瘤细胞的粘附、新生血管生成与重塑等环节产生影响。在血流中,血小板参与了肿瘤细胞周围血栓的形成,从而使肿瘤细胞免于自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)的清除。血小板在肿瘤细胞周围形成一层包膜,使肿瘤细胞粘附于血管壁,增强了肿瘤细胞从血管壁的外渗。血小板和肿瘤细胞相互作用可使血小板上的组织相容性复合物Ⅰ附着于肿瘤细胞,防止NK细胞的识别和上皮到间质的转换(Epithelial-Mesenchymal-Like Transition,EMT),以此促进肿瘤的侵袭转移。上述研究均证实血小板在促进肿瘤转移方面发挥及其重要作用,辐射损伤相关研究同时指出,射线对局部微血管内皮细胞存在显著的破坏作用,进而引发血小板聚集形成血栓。在胆管癌的放射治疗中,这一过程可能加剧肿瘤细胞与血小板的相互作用,从而增加其转移的风险。因此,既往研究提示血小板可能是促进胆管癌细胞侵袭转移的重要微环境因素,其具体效应和相关分子机制值得探索。另一方面,对多种肿瘤细胞自身的研究显示,射线照射可诱导粒细胞相关蛋白8(S100A8)表达水平的升高。研究发现,S100A8在肺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌及原发性肝癌等多种肿瘤组织中的表达明显升高。近期研究报道过表达S100A8可促进乳腺癌的侵袭及远处转移且与不良的临床预后明显相关。S100A8是一种已被公认的Toll样受体4(Toll-like receptor-4,TLR4)内源性配体,已知TLR4通路广泛参与了多种恶性肿瘤的转移。然而,S100A8在胆管癌转移中所扮演的角色依旧未知,基于临床放疗在胆管癌转移治疗中效果的不确定性以及辐照可诱导部分肿瘤细胞S100A8表达升高的发现,推测S100A8可能参与介导胆管癌细胞的侵袭转移,需要研究予以明确。因此,本课题以胆管癌细胞株为主要研究对象,结合裸鼠的胆管癌细胞肝转移模型以及临床病理标本的相关分子指标检测,研究血小板和S100A8基因对胆管癌侵袭转移的影响,在此基础上从血小板衍生因子(platelet derived growth factor,PDGF)调控的p38MAPK-MMP2/MMP9通路以及S100A8调控的TLR4/NF-κB-VEGF通路两个方向,研究血小板和S100A8诱导胆管癌细胞侵袭转移的分子机制。研究内容包括以下两个方面:首先,建立胆管癌细胞株RBE、HCCC-9810与人外周血血小板的共培养体系,分别采用transwell细胞侵袭实验和细胞迁移实验检测肿瘤细胞的侵袭和迁移能力,通过荧光标记结合激光共聚焦技术检测胆管癌细胞与血小板的粘附能力,western blot检测p38MAPK-MMP2/MMP9信号通路分子和EMT相关分子的表达。进一步在细胞共培养模型中分别加入PDGF受体(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)抑制剂CP-673451和p38MAPK通路抑制剂SB203580以检测胆管癌细胞侵袭和迁移能力、信号通路分子以及EMT相关分子表达的变化,观察细胞形态学改变。此外,收集临床胆管癌组织标本,采用western blot和ELISA检测组织标本的MMP2/MMP9蛋白表达,同时分析蛋白表达水平与临床病理参数的相关性。最后,建立BALB/c-nu小鼠胆管癌细胞的肝转移模型,检测肝转移灶并采用H&E染色观察肝组织病理学改变。另一方面,利用western blot检测射线对胆管癌细胞S100A8表达的影响,通过慢病毒转染的方法分别构建S100A8过表达的RBE细胞及S100A8敲低的HCCC-9810细胞,分别采用transwell细胞侵袭实验和细胞迁移实验检测肿瘤细胞的侵袭和迁移能力改变,ELISA方法检测细胞培养液中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的分泌水平,显微镜观察肿瘤细胞培养液对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)的微血管管腔形成的影响。进一步在转染细胞模型中分别加入TLR4的阻断剂TAK242,NF-κB的阻断剂PDTC以检测胆管癌细胞侵袭和迁移能力、培养液中VEGF分泌水平的变化,并采用western blot检测VEGF、P65等蛋白表达改变。此外,收集临床胆管癌组织标本,通过western blot、免疫组化以及ELISA检测组织标本的S100A8和VEGF蛋白表达和定位,同时分析蛋白表达水平与临床病理参数的相关性。最后,在建立的小鼠胆管癌细胞肝转移模型中,分别检测S100A8过表达或敲低的肿瘤细胞在肝内形成的转移灶,采用H&E染色观察肝组织病理学改变,细胞荧光标记结合肝脏切片观察胆管癌细胞的转移情况。本课题主要研究结果与结论如下:1、细胞侵袭和迁移实验表明胆管癌细胞株RBE、HCCC-9810分别与血小板共孵育后可明显增强肿瘤细胞的侵袭迁移能力。此外,细胞粘附实验表明血小板与肿瘤细胞存在明显粘附现象。结果证实血小板可促进胆管癌细胞的侵袭转移。2、胆管癌细胞与血小板共培养体系中发现,PDGFR抑制剂可显著抑制血小板诱导的胆管癌细胞侵袭和转移,影响血小板引起的肿瘤细胞形态学改变,同时消除血小板引起的肿瘤细胞EMT相关分子表达改变。临床胆管癌病理组织标本中观察到MMP2/MMP9表达水平较癌旁组织明显升高,统计分析发现MMP2/MMP9的表达与胆管癌患者淋巴结转移和术后预后不良显著相关,Kaplan-Meier生存分析显示MMP2/MMP9高表达与胆管癌患者的总体生存率显著降低相关。研究也发现血小板共培养可提高胆管癌细胞的MMP2/MMP9表达水平,而PDGFR抑制剂则可显著下调血小板诱导的MMP2/MMP9表达,提示血小板PDGF参与介导胆管癌细胞的MMP2/MMP9表达。3、胆管癌细胞与血小板共培养体系中发现,p38MAPK通路抑制剂处理可以阻断血小板诱导的胆管癌细胞的侵袭和转移。同时,选择性抑制p38MAPK通路可以显著下调血小板诱导的MMP2/MMP9表达,并消除血小板引起的肿瘤细胞EMT相关分子表达改变。实验也发现血小板诱导p38MAPK磷酸化水平升高。结合前期研究结果,提示血小板PDGF可能通过激活p38MAPK通路上调MMP2/MMP9,参与诱导胆管癌细胞的EMT改变和侵袭转移。4、在裸鼠的肝转移模型中发现,对照组胆管癌细胞RBE、血小板预处理的RBE细胞、以及PDGFR抑制剂和血小板联合处理的RBE细胞均能在小鼠肝内形成转移灶,但血小板预处理细胞的转化灶数目显著高于对照细胞,而抑制PDGF可以降低血小板诱导形成的RBE细胞肝转移灶数目。结果证实PDGF可促进胆管癌细胞在体内的侵袭转移能力。5、电离辐射可以显著提高胆管癌细胞的S100A8蛋白表达水平。在构建的S100A8高表达RBE细胞和S100A8干扰HCCC-9810细胞中发现,S100A8高表达细胞的侵袭能力提高,而干扰细胞的侵袭能力降低。临床胆管癌病理组织标本中观察到S100A8表达水平较癌旁组织明显升高,免疫组化检测发现S100A8蛋白主要表达于细胞胞浆和胞膜,统计分析发现S100A8蛋白表达水平与胆管癌患者的肿瘤分化程度和淋巴结远处转移显著相关,Kaplan-Meier生存分析显示S100A8高表达与胆管癌患者的总体生存率降低显著相关。最后,在裸鼠的肝转移模型中发现,S100A8在体内可明显诱导胆管癌细胞的侵袭转移,抑制S100A8可明显降低其侵袭转移能力。上述结果证实S100A8参与促进胆管癌细胞的侵袭转移。6、临床胆管癌病理组织标本中观察到VEGF蛋白表达水平较癌旁组织明显升高,免疫组化检测发现VEGF蛋白主要表达于胞浆和胞膜,统计分析发现VEGF蛋白表达水平与胆管癌患者的肿瘤分化程度和淋巴结远处转移显著相关,Kaplan-Meier生存分析显示VEGF高表达与胆管癌患者的总体生存率降低显著相关,此外,S100A8和VEGF联合高表达水平与胆管癌患者术后预后不良有显著相关性。在构建的S100A8高表达RBE细胞和S100A8干扰HCCC-9810细胞中发现,S100A8可以调控胆管癌细胞的VEGF分泌,过表达S100A8的胆管癌细胞的培养上清液可以促进HUVEC细胞微血管管腔的形成,VEGF中和抗体可抑制S100A8诱导的胆管癌细胞侵袭迁移能力。进一步采用TAK242、PDTC分别阻断TLR4和NF-κB后,观察发现胆管癌细胞的侵袭迁移能力降低,同时S100A8诱导的VEGF分泌、VEGF蛋白和磷酸化P65的表达均显著降低。上述结果证实S100A8通过调控TLR4/NF-κB-VEGF通路促进胆管癌细胞的侵袭转移。综上所述,本研究首次从血小板微环境因素及肿瘤细胞两个方面阐释了放射治疗对胆管癌侵袭转移可能产生的影响,并从血小板PDGF调控的p38MAPK-MMP2/MMP9通路及S100A8调控的TLR4/NF-κB-VEGF两条通路分析了其可能的分子机制。这些结果加深了对胆管癌侵袭转移机制的认识,为寻找胆管癌治疗的潜在靶标提供了新的方向和治疗策略。