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[目的]1.探讨本中心成人费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病（Ph+ALL）的初诊临床特征、治疗疗效和预后;对复发或难治Ph+ALL患者TKI耐药的患者进行临床特征、分子生物学特征、疗效预后分析。2.探讨ABL激酶区突变谱,突变对疗效和预后的影响。分析抗CD19CAR-T和异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）治疗对TKI耐药后复发或难治Ph+ALL伴T315I突变患者的预后改善情况。3.构建基于TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR）和微滴数字PCR（Droplet Digital PCR,dd-PCR）检测ABL激酶区T315I突变的新方法。探索两种方法在Ph+ALL复发患者中T315I基因突变检测和早期诊断的价值,指导临床个体化治疗。[方法]1.本研究系统性收集2011.01～2021.06期间本中心收治的405例Ph+ALL相关资料,包括临床信息、细胞遗传学、分子生物学、治疗方式以及患者随访资料等。分析TKI 一线治疗Ph+ALL患者的临床和实验室特征,回顾性分析TKI耐药Ph+ALL患者临床和生物学特征,分析三代TKIs、allo-HSCT对治疗疗效和生存的影响。2.回顾性分析159例Ph+ALL患者ABL激酶区突变的临床特征及突变对预后的影响。对比T315I突变和非突变患者的临床特征差别。中心早期采用sanger法检测ABL激酶区突变;后期应用二代测序技术（NGS）测序平台对ABL激酶区相关的基因突变进行目标区域PCR富集和高通量测序。3.收集ABL激酶T区315I突变Ph+ALL患者（经基因测序证实存在T315I点突变）和健康人的骨髓标本,合成T315I突变质粒。针对ABL激酶区T315I突变区域设计PCR扩增引物,将扩增产物构建到pGEM-T质粒载体并进行细菌转化;将挑取的克隆菌落在含氨苄青霉素的LB培养液中增殖大量转化质粒;提取T315I突变的质粒和T315野生型质粒,把构建的质粒和菌落送到苏州金唯智公司测序,借助新方法验证质粒和菌落的DNA情况;选择T315I点突变的质粒和T315I非突变型质粒通过大肠杆菌大量培养以生产质粒留用。用慢病毒包装系统构建T315I突变体表达的白血病细胞株（Sup-B15）。基于TaqMan-MGB探针设计RT-qPCR方法和dd-PCR方法检测T315I突变,优化引物浓度、解链温度、探针浓度,构建最佳反应体系,评估两种方法的敏感度、特异度、准确度。评估2种方法对T315I突变的检测效能和早期诊断[结果]1.初诊374例Ph+ALL患者资料相对完整,其中女性177例（47.3%）、男性197例（52.7%）,初诊时中位年龄39.5（14～78）岁,中位白细胞计数（WBC）39.5(1.0～650×109/L,中位血红蛋白（HGB）95（21～174）g/L,中位血小板计数（Plt）34（1～533）g/L。伴有附加染色体异常患者142例（38%）。1～2个诱导疗程的首次CR率92.9%,5年中位OS 58.4个月。二代TKI（达沙替尼、尼洛替尼）的疗效优于伊马替尼,复发率显著低于伊马替尼,均有统计学差异。诱导治疗后接受异基因移植的患者生存改善很明显,2年EFS、OS分别是61.3%和73.9%。初诊患者单因素分析中年龄、TKIs、CR、MMR具有统计学差异。多因素分析中MMR、allo-HSCT显示较好的改善预后作用。159例TKI耐药的患者从缓解到血液学复发,中位时间19月（4.8～109月）,从分子学复发到血液学复发约4.5月（0.6～30月）,他们初诊时年龄、白细胞较未耐药组高,有统计学差异（分别为p=0.001、P=0.026）;血液学反应和分子生物学反应低于未耐药组,具有统计学意义。二线TKI治疗复发患者,共有136例可评估,CR2 106例（77.9%）,再次CR率在没用TKI的患者是8例（32%）,伊马替尼患者12例（81.8%）,达沙替尼患者63例（89.4%）,尼洛替尼患者35例（87.5%）,普纳替尼患者19例（T315I突变）（90.5%）。61（58%）例获得MRD阴性。53（50%）例获得MMR,28（26%）例获得CMR。非TKI组、伊马替尼组、达沙替尼组、尼洛替尼组、普纳替尼组中位OS分别为6月、14.6月、22月、22.7月、30月（P＜0.05）;复发患者移植后的中位OS为26月,非移植患者仅为14月,（P=0.002）;单倍体移植对比全相合移植中位OS为21月、26月,（P=0.34）。2.159例TKI耐药患者有118（74%）例ABL激酶区突变,共24种类型突变,其中T315I突变最常见,占突变患者55.1%（65/118）,然后是E255K/V36.4%（43/118）和Y253H/F 16.1%（19/118）。ABL激酶区突变患者和非突变患者中位OS分别为23.5个月和未达到,统计学差异明显。5年生存率未突变组和突变组分别为63%和16%（P＜0.001）,突变患者和非突变患者中位EFS分别为6.6个月和未达到。回顾性分析ABL激酶区T315I非突变型309例,T315I突变型65例。针对MMR,T315I非突变99例,突变组10例（P=0.008）,TKI使用率和种类在两组中无明显差异,T315I非突变组患者CHR与突变组患者类似（92.3%vs90.8%）,分子生物学深度的缓解率为（34.5%vs16.9%）,（p=0.008）,T315I非突变和突变的两组患者在OS、EFS上均存在显著差异。抗CD19 CAR-T治疗27例成人复发Ph+ALL伴有T315I基因突变患者,其中同胞全相合移植6例（22%）,单倍体HSCT16例（59%）;24（88%）例达到CR,其中MRD阴性率70%（17/24）,中位RFS 20.5月（1-55月）,截至2021年12月31,中位OS 39月（8-76月）,5年生存率32%。其中12例CAR-T后桥接异基因HSCT,预后得到明显延长。CAR-T 细胞输注后无 CRS（cytokine release syndrome）9 例（33%）,轻中度 CRS有15例（55.6%）;2例（病例16、20）出现3级CRS,病例20同时合并HLH,病例3死于4级CRS。所有病例未出现CAR-T所致脑病综合征（CRES）。3.成功合成BCR-ABL融合基因激酶区T315I突变型质粒和野生型的质粒,成功构建基于TaqMan-MGB RT-qPCR和dd-PCR对ABL激酶区T315I突变的两种检测方法。TaqMan-MGB RT-qPCR体系得到最大优化,RT-qPCR方法的分析灵敏度约为10拷贝/ul;梯度稀释质粒后,dd-PCR对T315I突变质粒的检测敏感度为10～1拷贝/ul。回顾发现经既往Sanger测序法检测到6例T315I基因突变,而经本实验新建的dd-PCR方法多检测到2例T315I基因突变患者,其中1例初诊患者在TKI治疗后第3月就检测到T315I基因突变。利用Sanger法检测到的6例突变中,dd-PCR提前检测到3例T315I基因突变,分别提前了8个月、10个月、14个月,并检测到3例微突变,介于1-10copies/ul。2例患者提前给予普纳替尼、anti-CD19 CAR-T、异基因HSCT治疗,病情再次获得CR,中位生存期超44月,治疗反应和预后得到改善。新建的RT-qPCR方法能额外发现一例T315I突变,未能检测出dd-PCR检测到的3例微量突变。[结论]1、普纳替尼能改善Ph+ALL伴T315I突变患者疗效、预后。积极接受allo-HSCT可以显著改善成人复发Ph+ALL患者的预后,单倍体造血干细胞移植和全相合造血干细胞移植疗效相当,该优势突破既往无供体移植瓶颈。研究发现Ph+ALL治疗后复发、预后不良与TKI耐药存在密切关系。2.成人Ph+ALL患者发生TKI耐药大部分为ABL激酶区突变,最常见为T315I突变,其次为E255K/V,Y253H/F。相对于T315I非突变的Ph+ALL,T315I突变患者具有高白细胞,分子反应更低,预后更差的特点。Anti CD19 CAR-T治疗Ph+ALL复发后伴T315I突变患者,疗效可靠,不良反应可控,桥接异基因HSCT能改善患者长期预后。3.本研究成功构建RT-qPCR和dd-PCR检测ABL激酶区T315I突变的新方法体系。dd-PCR方法绝对定量检测T315I突变水平,敏感性优于RT-qPCR。Dd-PCR可实现对Ph+ALL复发患者T315I突变的早期检测和精准诊断。临床上体现较好的检测能力。依据dd-PCR高敏检测结果,指导临床用药以及个体化治疗,可以改善患者预后。需要进一步扩大临床样本来验证其全面的应用价值以及推广使用。