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本课题组前期对国内外绵羊品种进行了全基因组重测序分析,筛选出了一些与绵羊尾型相关的基因,其中BMP2(骨形态发生蛋白2,bone morphogenetic protein 2)和PDGF-D(血小板源性生长因子D,Platelet-derived growth factor-D)受到强烈选择。本试验选择BMP2和PDGF-D作为候选基因,进行分子水平和细胞水平验证,旨在为绵羊尾部脂肪沉积的调控提供基础研究资料,为分子育种提供可用的遗传标记。选取藏羊、湖羊两品种各30个个体的基因组样本分别等量混池,扩增BMP2和PDGF-D所有外显子及基因上下游1000 bp,使用飞行质谱对检测到的SNP位点进行基因分型,利用Haploview 4.1软件进行连锁不平衡分析,使用SAS 9.2软件将多态位点与尾型性状关联分析。同时,从胎羊尾部脂肪组织中分离原代前体脂肪细胞,对其进行培养扩增获得细胞水平验证的原材料。利用慢病毒载体将BMP2和PDGF-D基因稳定过表达于前体脂肪细胞中,用胰岛素进行诱导分化,利用q PCR和WB(Western blot)方法对脂肪细胞分化过程中的标记基因脂蛋白脂酶(LPL)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的表达量进行检测。对成熟脂肪细胞油红O染色观察脂滴形成情况。得到以下结果:1)在BMP2基因下游发现3个突变位点:g.48401619 T>A、g.48401272 C>A、g.48401136 C>T;在PDGF-D基因上游发现1个突变位点:g.3852134 C>T,内含子区发现1个位点:g.4122606C>G。2)BMP2基因的g.48401619 T>A、g.48401272 C>A和g.48401136 C>T位点与尾长呈显著相关(P<0.05);PDGF-D基因的g.4122606 C>G位点与尾长显著相关(P<0.05),g.3852134 C>T位点与尾宽显著相关(P<0.05)。3)BMP2基因的g.48401619 T>A、g.48401272 C>A和g.48401136 C>T三个位点中,g.48401272C>A和g.48401136 C>T之间存在强连锁。构成3种单倍型,6种组合基因型。其中CACT型和CCCT型个体在尾长、尾宽和尾周长上均处于优势,平均值较小,而CCCC型个体尾性状平均值相较于其他基因型较大。4)分离出的绵羊原代前体脂肪细胞呈不规则状或梭型,传代后仍具有较强增殖能力和分化能力。5)BMP2过表达组中,在m RNA水平,PPARγ和LPL的表达量均有上调,PPARγ在第0天和第1天显著高于对照组(P<0.05),LPL在第1天和第7天极显著高于对照组(P<0.01);蛋白水平各基因差异不明显。BMP2对体外绵羊前体脂肪细胞的分化有促进影响。6)PDGF-D过表达组中,PPARγ和LPL的表达呈显著上调趋势(P<0.05),与对照组相比,PPARγ仅在第0天未达到显著水平,LPL仅在第3天未达显著水平。WB结果显示试验组PDGF-D、PPARγ表达量较高。PDGF-D对体外前体脂肪细胞的成脂分化具有显著促进作用。