论文部分内容阅读
目的（1）通过研究Ad-EGFP-MDR1转染的骨髓造血细胞能否在体外有多药耐药基因1（multidrug resistance gene-1, mdr1）的功能性表达，是否能耐受大剂量霉酚酸脂（mycophenolate mofetil, MMF）的冲击，为下一步的体内实验提供参考和依据；（2）通过建立荷瘤的大鼠肝癌（liver cancer， LC）肝移植（liver transplantation，LT）急性排斥反应（acute rejection, AcR）动物模型，检测携带mdr1基因的受体骨髓造血细胞能否在体内有持续稳定的mdr1基因的功能性表达；（3）证实荷瘤的肝移植术后AcR大鼠，在接受携带mdr1基因的受体骨髓造血细胞移植后，能耐受短期大剂量MMF的冲击治疗，其肿瘤生长及AcR被明显遏制，为今后的临床工作提供实验参考。方法（1）将重组腺病毒Ad-EGFP-MDR1感染预行肝移植术的受体Brown Norway（BN）大鼠骨髓单个核细胞（bone marrowmononuclear cell，BMMC），通过台盼蓝拒染判断骨髓细胞存活情况；采用RT-PCR法和Western-blot法分别从基因及蛋白质水平检测mdr1基因在大鼠骨髓单个核细胞中的功能性表达；柔红霉素（daunorubicin，DAM）排出试验从功能水平检测mdr1基因在大鼠骨髓单个核细胞中的功能性表达情况；MTT法检测不同浓度MMF处理后转染的骨髓单个核细胞的存活情况。（2）于肝移植术前3天，分两次从中央尾静脉注入将转染mdr1基因3天的骨髓单个核细胞注入肝移植受体的BN大鼠体内；回输前受体大鼠接受压制死剂量的60Co-γ射线照射，腾空龛位；并同时分别以携空载及骨髓单个核细胞回输为对照组。（3）骨髓细胞回输后3天，按“二袖套法”建立以Lewis大鼠为供体，BN大鼠为受体的大鼠原位肝移植急性排斥反应动物模型；肝移植的同时，在左侧腋部皮下注入H22鼠源性肝癌细胞，建立荷瘤的大鼠肝移植急性排斥反应动物模型。（4）将受体BN大鼠随机分为未治疗组（未骨髓移植＋未化疗）、常规剂量化疗组（未骨髓移植＋常规剂量化疗）、超剂量化疗组（未骨髓移植＋超剂量化疗）、骨髓移植超剂量化疗组（未转染的骨髓移植＋超剂量化疗）、转染骨髓移植超剂量化疗组（转染骨髓移植＋超剂量化疗）。（5）采用RT-PCR法、Western-blot法和柔红霉素排出实验分别从基因、蛋白质和功能水平检测mdr1基因在骨髓移植后1月尚存活的受体大鼠骨髓细胞中的功能性表达。（6）于化疗前、化疗中1周，2周，3周及化疗结束后，取各组大鼠外周静脉血，计数红细胞（red blood cell, RBC）、白细胞（white blood cell, WBC）、和血小板（platelet，PLT），判断骨髓造血功能。（7）观察各组大鼠的存活情况，绘制生存曲线图；每周以游标卡尺计算肿瘤的最长径和最短径，计算瘤重。（8）于术后3、5和7天取各组存活大鼠，取静脉血及新鲜肝脏中叶组织标本，分析血浆中丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase，ALT)、天冬氨酸转移酶（aspartate aminotransferase，AST）和总胆红素（total bilirubin，TBIL）行肝功检测；肝脏标本做HE染色后光镜下观察其病理改变，判断有无急性排斥反应；计算急性排斥反应指数(rejection activity index, RAI)，并以Banff标准判定急性排斥反应严重程度。结果（1）流式细胞仪（flow cytometer，FCM）检测病毒转染率为30.14%，台盼蓝拒染检测细胞存活率为89.25%。（2）RT-PCR和Western-blot法检测到大鼠骨髓单个核细胞中转染的mdr1基因在基因、蛋白质水平都存在功能性表达，而未转染组没有mdr基因的表达；柔红霉素排出试验证实导入的mdr1基因表达产物P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）有药物外排泵功能，而未转染成功的细胞中出现大量柔红霉素聚集。（3）MTT法证实经过不同剂量的MMF处理后，转染mdr1基因的大鼠骨髓单个核细胞存活率没有明显差异（P>0.05）。（4）携mdr基因的骨髓单个核细胞移植后1个月受体骨髓中仍有外源性mdr1基因的功能性表达，而其它各组大鼠未见其表达。（5）LEW到BN大鼠组合方式的原位肝移植（orthotopic liver transplantation，OLT），联合腋部皮下肿瘤细胞接种，能够建立确切稳定的荷瘤大鼠肝移植急性排斥反应模型。（6）转染骨髓移植超剂量化疗组的大鼠的平均生存时间（42.20±12.44天）远较其它各处理组长（P<0.05），超剂量化疗组和骨髓移植超剂量化疗组的平均生存时间最短（8.60±5.72，10.20±4.28天）。（7）超剂量化疗组的大鼠肿瘤体积远较常规剂量化疗组和未治疗组大鼠的肿瘤较小，其差异有显著性（P<0.05）。（8）化疗开始后，转染骨髓移植超剂量化疗组大鼠的外周静脉血血白细胞、红细胞和血小板的计数远较其它未转染化疗组高（P<0.01），并且随着化疗的终止，有逐渐恢复正常的趋势。（9）各化疗药物组大鼠静脉血的ALT、AST和TBIL较未化疗组高（P<0.05），超剂量化疗的ALT、AST和TBIL较常规剂量组高（P<0.05）。（10）术后3天，各组RAI值无明显区别（P>0.05），术后5天及7天，转染超剂量化疗组和常规剂量组均较未治疗组RAI值为低（P＜0.05）；相比之下，超剂量化疗组RAI值较B组降低（P＜0.05）；随着时间的延长，未治疗组RAI值呈进行性升高的趋势，而转染超剂量组RAI值呈进行性降低的趋势。结论（1）体外研究发现采用携带目的基因的腺病毒载体转染体系，能成功将外源性mdr1基因转导入BN大鼠骨髓单个核细胞中，并存在mdr1基因的功能性表达；转染mdr1基因的大鼠骨髓单个核细胞能够在体外耐受大剂量乃至超大剂量的MMF。（2）程序性的骨髓移植法能成功的将转染mdr1基因的骨髓单个核细胞移植入BN大鼠；LEW到BN大鼠组合方式的原位肝移植，联合皮下肿瘤细胞接种，能够建立确切稳定的荷瘤大鼠急性排斥反应模型；骨髓单个核细胞移植后1个月受体骨髓中仍有外源性mdr1基因的功能性表达。（3）移植入荷瘤肝移植供体大鼠的mdr1基因的骨髓单个核细胞，能够保护骨髓造血功能，从而使受体能够耐受短期、超剂量的MMF冲击治疗，延长存活时间；短期、超剂量的MMF冲击治疗对大鼠肝移植术后肿瘤复发有明显的治疗效果，并能显著减轻受体大鼠肝移植术后的急性排斥反应。