随着大健康时代的到来,中医药的传承、发展迎来了新的曙光,面临着前所未有的机遇和挑战,毋庸置疑,中药的发展在其中发挥着举足轻重的作用。中药饮片在中医临床用药中发挥的核心作用正日益凸显,但指导其合理应用的中药炮制理论尚缺乏现代科学论据,临床用药混、乱、杂的现象依然存在,已成为制约中医药发展的瓶颈。中药炮制是一门大学问,药材经过炮制改变的不仅仅是成分,还有药效、药性、归经等,依据化学成分含量来定性中药质量不能充分反映其内在品质。本课题以中药五味子为研究对象,从五味子炮制前后物质基础的变化、生醋五味子木脂素类成分在大鼠体内代谢差异以及生醋五味子抗酒精性肝损伤的代谢组学等研究,较为系统深入的对五味子醋制内在机制进行探索,五味子的临床应用提供科学的理论依据。实验研究主要分三个部分:第一部分五味子醋制前后潜在化学标记物的筛选;第二部分为生、醋五味子提取物体内代谢研究;第三部分为生、醋五味子抗酒精性肝损伤作用的代谢组学研究,其中前两部分属于效应物质基础研究范畴。1.五味子醋制前后潜在的差异化学标记物研究 本研究建立了超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)与多元统计分析相结合的方法,迅速地筛选出炮制前后潜在的差异化学成分,即化学标记物。通过与文献或数据库的参考化合物比较质谱、保留时间和/或暂定分配的经验分子式来进行潜在化学标记物的鉴定。这些潜在的化学标记物不仅用于区分中药材和加工炮制品,而且还可能是效应物质基础的中药组成部分。利用上述方法,本研究筛选了五味子醋制前后差异性成分40个,其中生、醋五味子之间显著性差异成分8个(即化学标记物)。鉴定并确认了其中的5个化学成分,分别是5-羟甲基糠醛、五味子甲素及其同分异构体、五味子乙素和五味子酯丁。而其余3个化学标记物通过解析一级、二级质谱信息,推测它们很可能也属于木脂素类成分。其中的五味子乙素和5-羟甲基糠醛具有极显著性差异,被确定为最具代表的化学标记物。综上所述,五味子醋制前后其化学成分的确发生了一系列复杂的变化,尤其是木脂素类成分。因此,推测木脂素类成分为五味子醋制保肝的重要效应物质基础。2.生、醋五味子提取物肝损伤大鼠体内代谢研究 研究表明,五味子醇提取物中主要成分为木脂素,经对照品确认及含量测定的木脂素有五味子甲素(Deoxyschizandrin)、五味子乙素(Schisandrin B)、五味子丙素(Schisandrin C)、五味子醇甲(Schizandrol)、五味子醇乙(Schizandrol B)、五味子酯甲(Schisantherin)、五味子酯乙(Schisantherin B)、五味子酚(Schisanhenol)、戈米辛J(Gomisin J)及戈米辛G(Gomisin G)等,其中前8种木脂素含量较高。近年来,五味子木脂素代谢产物研究多局限于单体成分,提取物给药后体内的代谢研究还未见详尽的报道。近几年,国内外学者对五味子预防酒精性肝损伤的作用的研究较为普遍。大量研究也表明,五味子对急慢性肝损伤有较好的改善效果,因此,本研究选择较为经典、模型复制稳定可靠并受普遍认可的大鼠急性酒精性肝损伤模型作为研究对象。研究中药在体内的代谢产物,可逆向鉴定被吸收或者发生疗效的成分,大大加快有效成分群的确定,促进中药及其炮制品的物质基础与作用机制的揭示。本研究采用UPLC-Q-TOF/MS技术,并利用质量亏损滤过(MDF)方法,实现中药生物样品复杂基质中目标代谢产物的快速寻找,并对生、醋五味子醇提取物中的主要活性成分木脂素在大鼠体内代谢产物进行差异性比较研究。结果表明,木脂素在体内主要发生脱甲氧基、脱亚甲基及氧化反应;与原型化合物相比,相应的代谢产物的保留时间有所缩短,即极性增强。绝大多数木脂素代谢产物在生、醋五味子组的血浆、胆汁、尿液或粪便样品中都有分布,然而醋五味子组的代谢产物除M18外,其余的在胆汁中都有分布且含量较高,而生五味子组近一半的代谢产物未在胆汁中被检出或响应过低。五味子经醋制后的确改变了总木脂素的组成配比,从而导致一些木脂素成分的吸收、分布及代谢差异;醋五味子组的木脂素代谢产物在胆汁及粪便中的分布显著高于生五味子组。木脂素代谢产物在胆汁与粪便中的分布差异,提示其机理可能与“肝肠循环”及肠道菌群有关。通过上述研究,以期为进一步探讨五味子醋制增强保肝效应的物质基础和作用机制提供了重要依据。3.生、醋五味子抗酒精性肝损伤代谢组学研究 肝脏是机体物质代谢的中枢,其代谢转化与吞噬解毒功能对机体有重要保护作用。目前,文献报道的五味子治疗急性酒精性肝损伤(Acute alcoholic liver injury,AALI)作用机制的研究大多数是从药理作用、肝药酶等分子角度进行的。从代谢组学的视角探讨醋制对中药五味子的影响鲜有报道。课题组经前期研究发现,五味子醋制后可以促进大鼠的胆汁分泌,其胆汁排泄总量与生五味子组相比具有显著性差异,本研究以大鼠体内的血浆、胆汁生物样本为研究对象,从整体代谢组学的角度探讨醋五味子对酒精性肝损伤的影响。本研究采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)并运用模式识别的统计学分析方法,研究生、醋五味子进行药物干预后对AALI模型大鼠血浆、胆汁中代谢物组的扰动,挖掘潜在的生物标记物,寻找五味子预防或治疗AALI可能的作用机制,以期阐述五味子醋制后保肝作用增强的科学内涵。采用基于UPLC-Q-TOF/MS的代谢组学技术,并结合主成分分析(PCA)和正交校正的偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)等分析方法筛选、鉴定肝损伤相关的生物标记物。正常对照组、模型组、生五味子及醋五味子组血浆、胆汁代谢物谱得到明显分离,发现并鉴定了血浆中PC、PG、PE、TG、Phytosphingosine、Palmitoyl Serinol 等 21 个差异代谢物;胆汁中 LysoPC(20:4)、PG(18:0/18:1)、12-ketodeoxycholic acid、TG(64:2)等 20 个与肝损伤相关的潜在生物标志物。说明急性酒精性肝损伤大鼠的脂质代谢、胆酸代谢和氨基酸代谢等发生异常。AALI模型大鼠给予生、醋五味子后可使上述标志物代谢水平向正常状态转归,且醋五味子的调节作用强于生五味子(P<0.05),表明五味子经醋制增强抗肝损伤的作用机制可能与调节上述代谢途径相关。本课题在前期研究工作基础上,采用UPLC-Q-TOF/MS联用技术并结合多元统计分析方法,对中药五味子炮制前后物质基础的改变进行了分析,对五味子生品、醋品在大鼠体内的代谢排泄情况进行了系统的分析研究,并尝试通过代谢组学的方法揭示五味子醋制增强其抗肝损伤作用的内在机制。从化学成分、代谢谱、代谢组学相结合的外源性药物和内源性代谢物的角度共同探讨五味子醋制保肝的作用特点及机制。