【摘 要】
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D-甘露糖是D-葡萄糖C2位上的差向异构体,同时也是D-果糖的醛糖异构体。在化妆品、营养和制药行业有着广泛的用途。D-甘露糖已被提议用作婴儿和儿童的糖营养补充剂,其作为人类营养的益生元,具有各种健康优势。糖尿病、炎症和尿路感染均可以用D-甘露糖进行预防和治疗。D-甘露糖还经常被用作制造维生素、D-甘露醇和抗肿瘤药物的主要成分或原料。近年来,由于D-甘露糖具有巨大的商业应用价值,其需求量日益增加。目
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D-甘露糖是D-葡萄糖C2位上的差向异构体,同时也是D-果糖的醛糖异构体。在化妆品、营养和制药行业有着广泛的用途。D-甘露糖已被提议用作婴儿和儿童的糖营养补充剂,其作为人类营养的益生元,具有各种健康优势。糖尿病、炎症和尿路感染均可以用D-甘露糖进行预防和治疗。D-甘露糖还经常被用作制造维生素、D-甘露醇和抗肿瘤药物的主要成分或原料。近年来,由于D-甘露糖具有巨大的商业应用价值,其需求量日益增加。目前生产D-甘露糖的方法有三种,分别是绿色植物提取法、化学法和生物酶法,生物酶法相对前两种方法具有耗能低、对环境友好等优点被给予厚望。D-甘露糖异构酶（D-MIase）可催化D-果糖转化为D-甘露糖,是一种比较理想的D-甘露糖生产催化酶。本课题的研究内容总结如下:（1）本文从NCBI数据库中挖掘出三种不同来源的D-MIase,分别是来源于Deltaproteobacteria bacterium的Deba-D-MIase、来源于Caballeronia jiangsuensis的Caji-D-MIase和来源于Stenotrophomonas rhizophil的Strh-D-MIase。（2）对三种不同来源的D-MIase进行了基本的酶学性质鉴定,实验结果表明以上三种D-MIase的最适p H均为7.0,最适温度分别为55℃、50℃和50℃,最适二价金属离子为Mg2+、Mg2+和Ca2+并且为非金属依赖性酶;解折叠温度（Tm）分别为61.51℃、50.57℃和60.69℃。在最适条件下测得比酶活分别为322.3 U mg–1、275.6 U mg–1和267.2U mg–1。在50℃和55℃条件下测得Deba-D-MIase半衰期分别为376.7 min和231.8 min;Caji-D-MIase半衰期为28 min和6.5 min;Strh-D-MIase半衰期为66 min和7.8 min。以D-果糖浓度20-1600 m M来测定上述三种D-MIase的动力学参数,Deba-D-MIase的kcat为623.44 s-1,Km为539.75 m M,kcat/Km为1.16 s-1m M-1;Caji-D-MIase的kcat为734.53 s-1,Km为515.47 m M,kcat/Km为1.42 s-1m M-1;Strh-D-MIase的kcat为352.84 s-1,Km为260.89m M,kcat/Km为1.35 s-1m M-1。以浓度50 g/L和100 g/L的D-果糖来生产D-甘露糖,以上三种不同来源的D-MIase的平衡转化率约为25%。（3）选择表现最优的Deba-D-MIase进行热稳定性改造,使用Fire Prot辅助设计出突变体R37K、A76V、N89M、N109F、S125Y、G164L、S178M、N234D、I239L。实验结果表明所设计的单点突变体中R37K和G164L为阳性突变体,将单点突变体进行叠加得到双点突变体R37K/G164L。通过实验测得双点突变体R37K/G164L在60℃的半衰期为野生酶Deba-WT的4倍,最适温度为55℃未发生变化,比酶活为327.3 U mg–1与野生酶Deba-WT相比较几乎没有下降。
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