肿瘤复发在传统化/放疗后比较常见,肿瘤复发往往伴随着癌细胞恶性程度的进一步上升,包括耐药性和转移性的增加,导致后续治疗更为困难,患者生存率降低。近年来研究发现,多种化疗药物在抑制肿瘤细胞生长的同时也会诱导肿瘤细胞恶性增强,可能是导致肿瘤复发的原因之一。脂质体是一种常见的药物载体,可以缓释药物,改变细胞摄取药物的模式,极大地减少了化疗药物的副作用,增加了安全性。然而,脂质体制剂对肿瘤恶性程度影响的报道仍不多见。本研究以阿霉素为模型药物,首先考察了阿霉素脂质体对肿瘤细胞转录组的影响,探讨了阿霉素脂质体药物释放与肿瘤细胞恶性相关基因表达的关系。通过薄膜分散法和硫酸铵主动载药法制备了释药缓慢的 HSPC DOXlipo(Hydrogenated soy phosphatidylcholine doxorubicin liposomes)和释药迅速的 DPPCDOXlipo(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine doxorubicin liposomes)。部分 HSPC DOXlipo 依赖网格蛋白介导的内吞入胞,而DPPCDOXlipo阿霉素入胞方式与游离阿霉素更为接近。基因芯片是一种高通量的,灵敏快速检测mRNA表达差异的方法,在阿霉素抗肿瘤的机制研究中已有应用。本研究在考察脂质体对细胞摄取阿霉素的影响后,采用了高通量的表达谱芯片方法考察阿霉素脂质体对肿瘤细胞转录组的影响。阿霉素早期主要改变DNA的损伤与修复相关基因。阿霉素脂质体的药物缓释延缓了包括耐药基因ABCB1等肿瘤恶性相关基因的表达,并且减缓了阿霉素诱导的肿瘤细胞早期迁移。结合转录组分析结果和文献调研,GPR87与肿瘤生存密切相关,可促进肿瘤细胞增殖或转移,可能与化疗诱发的肿瘤恶性转化有关。因此,选择GPR87为靶基因设计siRNA,构建siGPR87/阿霉素共载脂质体,结果表明,siGPR87可以抑制阿霉素诱导的ABCB1、Twist1、Nanog肿瘤恶性相关基因上调。鉴于单纯利用载体改变药物释放并不能达到逆转肿瘤恶性转化的目的,本研究进一步采用两药联用的方式,以期在抑制肿瘤的同时防止阿霉素耐药发生。流行病研究显示:二甲双胍具有降低肿瘤致死率和复发率的作用,因此本研究选择阿霉素与二甲双胍联用,考察并探讨了两药协同抗肿瘤的效果和逆转耐药表型的机制。本研究首先发现二甲双胍具有抑制阿霉素耐药细胞MCF7/ADR的能力,可诱导细胞凋亡、周期抑制。进而考察其作用机制发现,二甲双胍具有显著的线粒体毒性,可引起线粒体膜电位下降、刺激ROS产生、降低ATP水平、抑制细胞耗氧率。肿瘤微环境可改变二甲双胍的细胞毒性,特别是糖饥饿显著增强了二甲双胍的毒性。体内研究发现,二甲双胍能显著抑制MCF7/ADR耐药肿瘤的生长,并降低Ki67阳性细胞的比例。在考察二甲双胍抗MCF7/ADR的作用机制的基础上,继续考察二甲双胍和阿霉素联用的效果。二甲双胍可以通过促进细胞摄取阿霉素发挥两种药物的协同效应。更重要的是,二甲双胍在mRNA水平上抑制多种耐药基因的表达,包括ABCB1、ABCC1、ABCC2、ABCG2,可以逆转阿霉素诱导的耐药基因表达上调。蛋白水平的研究表明,二甲双胍可通过AMPK/mTOR/HIF1α信号通路抑制Pgp表达。体内研究发现,二甲双胍和阿霉素联用增强了体内抗MCF7/ADR耐药肿瘤的效果,同时降低了肿瘤组织内Pgp的表达,提示二甲双胍具有逆转肿瘤耐药表型的作用。由于二甲双胍存在跨膜困难,体内半衰期短的问题,本课题进一步采用脂质体为载体,构建阿霉素/二甲双胍的共载脂质体,更有效地将两种药物传递到肿瘤部位。首先通过优化二甲双胍单载脂质体处方,选择PEG修饰的阳离子脂质体为载体,以促进MCF7/ADR摄取二甲双胍。随后通过阿霉素脱盐疏水化,制备阿霉素/二甲双胍共载脂质体,体外释放实验表明脂质体对两种药物都有缓释作用。细胞毒性实验结果表明,阿霉素/二甲双胍共载脂质体具有比游离阿霉素及阿霉素单载脂质体更强的细胞活性抑制作用。根据前期研究结果,二甲双胍对细胞耗氧率有明显抑制作用。因此,进一步研究了阿霉素/二甲双胍共载脂质体对肿瘤缺氧微环境的影响。缺氧是体内诱发肿瘤恶性转化的重要原因之一,与耐药发生密切相关。阿霉素/二甲双胍共载脂质体较阿霉素单载脂质体显著抑制了 MCF7/ADR的氧气消耗,因此可以缓解肿瘤内缺氧。阿霉素/二甲双胍共载脂质体还可通过AMPK/mTOR信号通路抑制HIF1α和Pgp的表达,从而减少缺氧诱导的耐药发生。体内分布实验显示PEG修饰的阳离子脂质体具有明显的增强渗透滞留(EPR)效应,可以有效增加药物的肿瘤靶向性。光声实验结果表明,阿霉素/二甲双胍共载脂质体可增加肿瘤内部和边缘部位血管中的血氧饱和度,从而缓解肿瘤缺氧微环境。体内抑瘤实验结果表明,阿霉素/二甲双胍共载脂质体较游离阿霉素和阿霉素单载脂质体发挥更强的肿瘤抑制效果,并消除Ki67阳性细胞,提示通过改善缺氧微环境可更有效抑制耐药肿瘤,发挥药物协同作用。本研究结果表明:脂质体通过改变细胞摄取阿霉素模式减缓肿瘤恶性表型的发展,联用阿霉素和二甲双胍在一定程度上可逆转阿霉素诱导的耐药表型。进一步构建阿霉素/二甲双胍共载脂质体促进了药物的摄取和肿瘤靶向,并通过降低细胞的耗氧率,改善肿瘤部位的缺氧微环境,从而发挥更强的抑瘤作用并防止肿瘤的恶性转化。本研究为今后预防阿霉素耐药产生和多药耐药肿瘤的治疗提供理论依据及新的策略。