【摘 要】
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研究利用原核融合表达系统及Western blot等实验方法,检测了β-APK1、GRF/c、IRS-1、PLCγ-2/n和Btk等5种分子来源的PH结构域与PKC的结合及其对PKC活性的影响,并进一步定位
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研究利用原核融合表达系统及Western blot等实验方法,检测了β-APK1、GRF/c、IRS-1、PLCγ-2/n和Btk等5种分子来源的PH结构域与PKC的结合及其对PKC活性的影响,并进一步定位了PKC与PH结构域结合的部位.实验分以下几部分进行:实验首先构建了7种PH结构域的原核表达载体(β-ARK1,GRF/c,IRS-1,PLCγ-2/n,Btk,GAP和SOS-1),结果获得了β-ARK1、GRF/c、IRS-1、PLCγ-2/n和Btk等5种PH结构域与GST的融合表达,所表达融合蛋白的95%为可溶性,经agarose beads纯化,获得了高纯度的5种GST-PH结构域融合蛋白;随后,以人T细胞白血病细胞(Jurkat细胞系)中固有的PKC为来源,进行了PH结构域与PKC的体外结合实验.western blot检测发现5种GST-PH结构域所在泳道均有PKC的存在,胆未栓出单纯GST对照与PKC的作用,表明5种PH结构均可在体外与PKC牧特异性结合.尽管实验仅在体外进行,但仍为研究人员寻找PH结构域的生理配基提供线索,PKC是否为PH结构域的生理配基有待体内实验证实,另一方面,为研究人员更深入地探讨二者在信号转导中的作用有所帮助.为阐明PH结构域与PKC相互作用的生物学意义,该研究观察了上术几种PH结构纯化蛋白对PKC活性的影响.为确定PKC与PH结构域的结合部位,该研究同时应用原核表达载体pRSET-A获得了PKC调节区的可溶性6-His融合表达蛋白,用产物的可溶性部分进行了体外结合实验.
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