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目的：体外观察ING4在胶质瘤组织中的表达情况,并构建人ING4基因的重组表达质粒,将其转导入人胶质瘤U87MG细胞株,观察ING4的高表达对U87MG细胞生长、增殖、凋亡等生物学行为的影响,同时研究ING4对U87MG细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响,从而探讨ING4在体内外抑制恶性肿瘤增殖及对凋亡的促进作用的分子机制。
方法：(1)采用免疫组化法观察ING4在人脑不同级别胶质瘤组织中的表达。(2)通过RT-PCR法从正常的人组织获得ING4基因片段,将其克隆入空载质粒pcDNA3.1,构建重组表达质粒pcDNA3.1-ING4。采用双酶切及基因测序对重组质粒进行鉴定。(3)将pcDNA3.1-ING4转导入人胶质瘤U87MG细胞株,经G418筛选后建立稳定转染的细胞克隆,采用免疫细胞化学及蛋白印迹法对克隆细胞进行鉴定。空载质粒pcDNA3.1进行转染作为对照。(4)MTT法、细胞生长曲线、克隆形成实验检测ING4对U87MG细胞增殖的影响；电子显微镜观察、TUNEL法检测ING4对U87MG细胞凋亡的影响；流式细胞仪检测细胞周期的分布情况。此外,采用蛋白印迹法检测ING4对增殖及凋亡相关蛋白p27、SKP2、cyclinD1、COX-2、IGF-1、Bcl-2、Bax、Cyt-c、caspase 3、PARP、BCLX/L表达量的影响。(5)建立转染前及分别转染该两种质粒的胶质瘤细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,观察三周内瘤组织的变化并计算抑瘤率。(6)模型动物后处死、取材,应用常规病理HE染色法及免疫组化法观察移植瘤组织ING4蛋白的表达情况。
结果：(1)ING4在人脑不同级别胶质瘤组织中的表达差异显著,随着胶质瘤病理分级的增高,抑癌基因ING4的表达明显减少。(2)经双酶切及基因测序证实重组质粒构建成功,经免疫细胞化学及蛋白印迹法证实转染细胞可高效表达ING4蛋白,转染模型成功建立。(3)高表达的ING4能够抑制U87MG细胞的增殖,增加其凋亡,并能够抑制U87MG细胞的细胞周期进程,使细胞周期阻滞在G1/S期。(4)皮下移植瘤组织中转染pcDNA3.1-ING4质粒的U87MG细胞蛋白ING4的表达明显高于转染pcDNA3.1质粒U87MG细胞及转染前细胞。(5)ING4可抑制U87MG细胞皮下移植瘤的生长。
结论：ING4在胶质瘤组织中的表达随着胶质瘤级别的增高而明显降低,其可能参与了胶质瘤的发生、发展,并可能为胶质瘤发生机制之一。ING4的高表达在体外以及体内能够有效地抑制胶质瘤U87MG细胞细胞的生长,并可影响其细胞周期的进程及明显增加其凋亡。ING4对U87MG细胞增殖的抑制作用及凋亡的促进作用,可能是通过对其细胞周期以及凋亡信号通路活化的调控而实现的。