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本论文在充分调研国际有关蟾酥和蟾蜍灵凋亡研究进展的前提下,首先概述了有关细胞凋亡和其相关蛋白的基本信息以及细胞凋亡通路的调节,接着总结了蟾酥和蟾蜍灵治疗肿瘤的机制,然后对激光共聚焦扫描显微镜和荧光共振能量转移技术的原理和应用进行了概况性的介绍。本论文的实验研究主要包括两部分:
第一部分主要在肺腺癌细胞(ASTC—a—1)中,运用FRET技术和共聚焦显微技术研究了蟾酥诱导Bax转位,线粒体膜电位改变和caspase—3活性的作用机理。主要研究结果包括:(1)蟾酥以剂量依赖性的方式诱导细胞凋亡;(2)利用荧光共聚焦成像技术和FRET技术实时在单细胞中检测到蟾酥诱导GFP—Bax的动态的转位过程(3)利用流式细胞仪证明了蟾酥诱导线粒体膜电位的下降,说明了蟾酥诱导凋亡经过了线粒体途径(4)利用荧光受体漂白技术和荧光光谱检测技术证明了蟾酥诱导caspase—3的活化,说明caspase—3参与了蟾酥诱导的细胞凋亡。我们的研究结果扩展了蟾酥诱导细胞凋亡通路的内容。
第二部分主要运用基于FRET的荧光共聚焦显微镜技术、荧光受体漂白技术和荧光光谱检测技术在人肺腺癌细胞(ASTC—a—1)中研究了蟾蜍灵诱导细胞凋亡的机制。用DCFH—DA荧光探针检测活性氧(ROS)的产生;采用基于FRET技术的SCAT9、FRET—Bid和SCAT3荧光基因报道探针来检测单个活细胞内caspase—9、caspase—8和caspase—3的活性;用Cty—c—GFP荧光基因报道探针来检测细胞中细胞色素C的释放。主要研究结果包括:(1)蟾蜍灵可以引起ROS的快速产生;(2)蟾蜍灵诱导了ROS依赖性的凋亡、Bax的转位、线粒体膜电位的下降和caspase—3的激活;(3)蟾蜍灵不能激活caspase—9,也不能诱导细胞色素C从线粒体释放;(4)蟾蜍灵可以激活caspase—8。以上结果暗示了蟾蜍灵诱导细胞凋亡同时经过了caspase—8的外源凋亡途径和ROS依赖性的线粒体凋亡途径。