严重急性呼吸综合症(SARS)，是本世纪人类遭遇的一种新的严重感染性疾病，对全球经济和公共卫生造成了严重威胁。SARS冠状病毒(SARS—CoV)的迅速发现和认定为SARS的诊断、疫苗和药物研究奠定了基础。SARS的动物宿主至今尚无定论，因此，持续的监测人和动物感染SARS—CoV和进行流行病学研究至关重要。本文围绕SARS—CoV特异性抗原基因的筛选、鉴定，以SARS—CoV全病毒抗原、N全长基因重组蛋白为对照，筛选确定了N蛋白基因缺失C端的576bp基因片段，进行克隆、表达，获得SARS—CoV特异性诊断抗原N199；并采用间接ELISA法对N199蛋白作为诊断抗原的灵敏性和特异性进行了系统的评价，旨在为SARS—CoV的检测诊断提供理论和实践依据。主要研究结果如下： ⑴SARS—CoV F69株的分离鉴定：建立了SARS—CoV规模化培养体系，采用甲醛灭活，制备了灭活全病毒抗原，为特异性诊断抗原的评价奠定基础。 ⑵用SARS—CoV F69株制备的全病毒灭活抗原免疫马、猪制备特异性抗血清，为特异性诊断抗原的评价奠定基础；同时，高收获量、高纯度的马抗SARS—CoV高免球蛋白F(ab)2片段的制备也为SARS的被动免疫治疗提供了技术和物质储备。 ⑶SARS—CoV N和N199基因的克隆与序列测定：设计合成特异性引物，PCR扩增目的基因，通过双酶切，将N、N199基因的酶切片段分别克隆到pET28a(+)载体。然后转化宿主菌E.coli DH5α，成功地获得了N、N199基因的重组子pET28a—N和pET28a—N199。对重组质粒pET28a—N和pET28a—N199进行基因序列测定，基因序列测定结果表明连接基因与设计的序列相符。 ⑷SARS—CoV N和N199蛋白的表达和纯化：重组质粒pET—28a—N和pET—28a—N199转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，成功获得重组蛋白。所表达的重组蛋白N和N199均以可溶性的形式存在，表达量分别约占菌体总蛋白的28.8％和35.0％左右。用SDS-PAGE对重组蛋白进行分析鉴定。结果表明重组蛋白是所预期的目的蛋白。利用Ni—NTA亲和层析纯化，获得了纯度较高的重组N、N199蛋白。Western Blot对重组N和N199蛋白进行鉴定，结果显示重组N和N199蛋白获得了高表达，具有较好的免疫反应性，能够和SARS特异性抗体结合。 ⑸SARS冠状病毒特异性诊断抗原的初步应用：采用间接ELISA法，用制备的SARS—CoV全病毒、N和N199重组蛋白抗原分别检测SARS恢复期病人血清、健康人血清、猪血清，并检测灭活SARS病毒抗原免疫的猪血清IgG抗体和中和抗体。结果表明，相对于SARS全病毒灭活抗原和N蛋白抗原，N199蛋白抗原具有较高的灵敏性和特异性，作为避免交叉反应的诊断抗原是可行的，为SARS的动物宿主监测和流行病学研究提供了一种有价值的血清学诊断方法。