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Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是一类跨膜蛋白家族,通过识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)诱导先天性免疫应答。TLRs被认为是最有特点的先天性受体,在宿主抗感染免疫中发挥重要作用。不同的TLRs识别特定的分子标志并且启动先天性免疫应答,如TLR2和TLR3复合物或TLR2和TLR6复合物识别脂肽或脂蛋白,TLR3识别病毒的双链RNA,TLR4识别脂多糖,TLR5识别鞭毛蛋白,TLR7和TLR8识别单链RNA,以及TLR9识别细菌的CpG-DNA。TLR5是一类限制性表达受体,主要表达在上皮细胞、单核／巨噬细胞、树突状细胞(DC)等细胞的表面。鞭毛蛋白是TLR5的特异性配体,TLR5识别鞭毛蛋白后,启动MyD88依赖的信号通路,激活转录因子(NF-κB)诱导前炎性细胞因子的产生。目前,针对先天性免疫应答的研究主要以人或小鼠为模型,而对于家禽的研究则较为少见,主要是由于缺乏与家禽相关的生物试剂材料。因此,本研究构建表达了鸭TLR5分子的胞外区(ECD)片段,并制备了针对TLR5(ECD)的单克隆抗体,以期为家禽先天性免疫应答研究提供材料。本研究以实验室前期制备的鸭TLR5 cDNA为模板,设计合成引物,利用高保真DNA聚合酶扩增鸭TLR5 (ECD)基因片段,片段大小为1608 bp。将扩增的目的基因片段连接于pMD20-T克隆载体,经筛选鉴定正确后,将目的基因分别连接于原核表达载体pCold-1和pGEX-6p-l,经筛选鉴定正确后,分别将构建的原核重组质粒pCold-1-TLR5和pGEX-6p-1-TLR5转化宿主大肠杆菌BL21,从而构建出重组菌pCold-1-TLR5/BL21和pGEX-6p-1-TLR5/BL21.将重组菌pCold-1-TLR5/BL21和pGEX-6p-1-TLR5/BL21分别接种于含有Amp的LB液体培养基中,加入IPTG诱导重组融合蛋白的表达,收集菌体,超声波裂解菌体,离心后分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳,根据电泳结果判定,重组融合蛋白rHis-TLR5和rGst-TLR5均表达在包涵体中。以重组融合蛋白rHis-TLR5为免疫原免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠,应用B淋巴细胞杂交瘤技术,通过间接ELISA方法和2次亚克隆筛选,获得6株能够稳定的分泌抗TLR5单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1C10、485、589、5811、5F9和6D7。对获得的6株细胞株分别进行培养上清效价、腹水效价和抗体亚类测定。结果显示,1C10、485、589和6D7的培养上清效价均在104以上；5811株腹水效价低于106,其余均在107。抗体亚类鉴定显示,5F9株为IgG1,其余5株均为IgM。对收集的腹水单克隆抗体进行透析处理,然后用rProtein A Sepharose 4B亲和层析柱纯化,收集纯化后抗体进行SDS-PAGE凝胶电泳,电泳显示6株抗体的纯化效果整体较好。Western blotting结果显示,每株抗体均与经诱导的重组菌pCold-1-TLR5/BL21和pGEX-6p-1-TLR5/BL21发生特异性反应,出现与目的蛋白一致的特异性条带,不与空载体重组菌pCold-1/BL21和pGEX-6p-1/BL21发生特异性反应。将构建的重组真核质粒pCDNA3.1-TLR5瞬时转染HEK293T细胞,分别以制备的6株单克隆抗体为一抗,以FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗,进行间接免疫荧光试验,结果均可以观察到明显的荧光,表明所制备的单克隆抗体与真核表达的TLR5分子可发生特异性结合。将制备鸭脾脏淋巴细胞,以单克隆抗体5F9为一抗,以FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗,进行流式细胞术分析,结果表明单克隆抗体5F9可以特异性的识别鸭脾脏淋巴细胞。本研究成功表达了鸭TLR5胞外区的蛋白片段TLR5(ECD),所获得的单克隆抗体可与真核表达的鸭TLR5分子发生特异性的结合,并且单克隆抗体5F9可以用于流式细胞术分析,预示着抗体具有良好的应用前景。