论文部分内容阅读
研究背景脑胶质瘤（Glioma）是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,外科手术切除联合放疗及化疗是临床上最主要的治疗策略。即使脑胶质瘤患者接收积极治疗,但是仍然会短期内再次发病。脑胶质瘤的免疫治疗作为一种新策略,虽然取得了众多进展,但是各项临床试验鲜有成效,其主要原因在于胶质瘤存在抑制性免疫微环境。其中有各不相同多的免疫细胞,能够促进胶质瘤的恶性进展。肿瘤相关巨噬细胞（Tumor associated macrophages,TAMs）作为胶质瘤微环境中浸润的最主要的免疫细胞（占30%以上）,与胶质瘤恶性程度密切相关。研究发现,巨噬细胞活化状态下存在M1型和M2型两种功能大相径庭的类型。在肿瘤微环境中。其中,M2型TAMs分泌数量较多的抗炎及促肿瘤因子,从而参与抑制抗肿瘤免疫作用,促进肿瘤恶性进展。因此,M2型TAMs能够显著地促进脑胶质瘤抑制性免疫微环境形成。此外,实体肿瘤微环境还具备低氧的特征,其与肿瘤血管形成、侵袭、迁移等相关,还在肿瘤抑制性免疫微环境的形成过程中发挥关键作用。我们曾经报导脑胶质瘤中存在广泛的低氧区,且微环境中浸润着大量TAMs（以低氧区尤甚）,其中M2型数量越多,胶质瘤缺氧越严重,同时胶质瘤级别越高。通过深入研究,我们首次发现低氧微环境中的胶质瘤细胞还能通过大量分泌POS TN等细胞因子,诱导TAMs向M2型显著极化。研究表明,上调TAMs的白噬水平同样能够促进其M2型极化。因此,白噬途径可能在TAMs的M2型极化中起到重要的作用。自噬（Autophagy）是通过包裹自身受损或衰老的细胞器等非必需细胞内容物,从而形成自噬小体并将其分解转化为细胞所需的基本成分,以维持细胞生存需求。因此,当细胞处于饥饿、低氧、免疫损伤以及放化疗状态时,细胞自噬功能活跃。由于肿瘤细胞增殖极其活跃,肿瘤核心区缺血缺氧严重,自噬也成为低氧细胞生存的关键。胶质瘤细胞主要通过囊泡分泌的方式将白细胞介素（Interleukin,IL）6等细胞因子释放入微环境中,而外泌体作为一种重要的调控性外分泌囊泡能够携带大量的IL-6等细胞因子,靶向微环境中的免疫细胞。因此,低氧胶质瘤细胞可能通过分泌外泌体的方式,参与TAMs自噬及M2型极化过程,其中IL-6相关通路可能起到了关键的作用。本文主要研究低氧胶质瘤外泌体传递的IL-6/miR-155-3p在TAMs自噬及M2型极化中的作用机制。首先,我们在细胞实验和动物实验中均证实低氧胶质瘤外泌体通过上调巨噬细胞自噬水平诱导其M2型极化,进而促进胶质瘤恶性进展。随后,我们证实低氧胶质瘤外泌体富集IL-6和miR-155-3p并能被递送给巨噬细胞,确定经IL-6激活STAT3通路及miR-155-3p靶向环磷腺苷效应元件结合蛋白转录调控因子（cAMP-response element binding protein regulatory factor,CREBRF）发挥作用。我们证实 IL-6 和 miR-155-3p 可以通过IL-6/pSTAT3/miR-155-3p/自噬/pSTAT3正反馈环诱导巨噬细胞M2型极化,促进胶质瘤恶性进展。综上所述,本研究围绕胶质瘤细胞的抑制性免疫微环境、自噬及其恶性生物学行为进行了研究,提出IL-6和miR-155-3p可能是治疗胶质瘤潜在的生物标志物,靶向自噬和STAT3通路的治疗可能会逆转肿瘤抑制性免疫微环境,继而发挥肿瘤相关治疗作用。1.目的（1）探讨低氧、胶质瘤外泌体、M2型极化以及自噬等之间的相互关系。（2）证实低氧诱导的胶质瘤细胞外泌体高表达IL-6和miR-155-3p,并且二者在低氧胶质瘤细胞外泌体处理的巨噬细胞中的表达水平升高。（3）揭示IL-6和miR-155-3p对巨噬细胞自噬及M2型极化的具体作用机制。2.方法（1）外泌体的分离和鉴定通过超速离心和沉淀法分离胶质瘤细胞外泌体,并使用透射电镜及western blot鉴定。（2）体外实验中自噬的相关检测自噬强度反应指标:共聚焦荧光显微镜检测巨噬细胞稳定转染mCherry-GFP-LC3后的LC3点状聚集的数目;评估自噬蛋白表达量;使用相关通路抑制剂3-MA及S3I-201处理巨噬细胞并观察其对自噬的影响等。（3）IL-6和miR-155-3p表达水平的检测Western blot检测不同处理组IL-6蛋白的区别。QRT-PCR检测miR-155-3p在外泌体和巨噬细胞内的表达量。（4）细胞转染及稳定表达IL-6及miR-155-3p的单核细胞系的构建构建miR-control、miR-155-3p mimics以及含有野生型或突变型结合序列的CREBRF的相关质粒,并行转染实验,对目的分子进行过表达,进而研究miR-155-3p 与 CREBRF 的 3’UTR 的结合。稳定表达Control、IL-6、miR-control和miR-155-3p的慢病毒分别转染U937和THP-1细胞系以构建稳定表达IL-6和miR-155-3p的单核细胞系。（5）巨噬细胞M2型极化的相关检测QRT-PCR评估M1型和M2型极化相关分子（TNFA和CD163）的表达水平;使用STAT3抑制剂S3I-201处理观察其对巨噬细胞M2型极化的影响等。（6）胶质瘤细胞增殖能力的检测EdU实验评价胶质瘤细胞与不同处理组巨噬细胞共培养后的增殖活性。（7）胶质瘤细胞迁移能力的检测Transwell迁移实验评估胶质瘤细胞与不同处理组巨噬细胞共培养后的迁移活性水平;使用相关通路抑制剂3-MA和S3I-201处理监测其对胶质瘤细胞迁移活性水平的影响。（8）体内成瘤实验构建裸鼠颅内原位成瘤模型,将胶质瘤细胞与巨噬细胞共同原位注射于实验鼠脑内,监测活体肿瘤状况,观察记录不同实验组生存状况,处死后取其脑组织进行检测评价肿瘤的侵袭能力和增殖活性。3.结果（1）胶质瘤外泌体的鉴定与巨噬细胞吞噬胶质瘤外泌体透射电镜和western blot检测确认胶质瘤外泌体。共聚焦显微镜观察证实巨噬细胞能够吞噬胶质瘤外泌体。（2）低氧胶质瘤外泌体上调巨噬细胞自噬水平MCherry-GFP-LC3荧光结果和western blot结果均提示低氧胶质瘤外泌体处理能够上调巨噬细胞的自噬水平,同时可以被3-MA阻断。（3）低氧胶质瘤外泌体正性调节巨噬细胞的M2型极化QRT-PCR、流式细胞术和ELISA结果均证实巨噬细胞的M2型极化可以被低氧胶质瘤外泌体诱导。（4）低氧胶质瘤外泌体处理的巨噬细胞促进胶质瘤恶性进展体外实验结果显示与低氧胶质瘤外泌体共培养的巨噬细胞促进胶质瘤的增殖和迁移能力。体内实验结果显示胶质瘤细胞与低氧胶质瘤外泌体处理的巨噬细胞共注射组的实验鼠肿瘤的恶性程度更高。（5）低氧胶质瘤外泌体富集IL-6和miR-155-3p并能被递送给巨噬细胞Western blot结果显示低氧胶质瘤外泌体IL-6表达水平显著上调,QRT-PCR检测结果表明低氧胶质瘤外泌体miR-155-3p表达水平显著上调,而且二者均通过外泌体被递送给巨噬细胞。（6）IL-6经活化STAT3通路促进巨噬细胞的自噬MCherry-GFP-LC3荧光和western blot数据均提示高表达IL-6可以上调巨噬细胞的自噬水平,同时S3I-201能抑制该自噬上调。（7）MiR-155-3p调控巨噬细胞自噬水平的具体分子靶点和机制QRT-PCR实验提示高表达IL-6可以促进miR-155-3p的分泌量。相关实验表明miR-155-3p高表达增强巨噬细胞的自噬程度,S3I-201不能抑制该自噬上调。通过miRDB及TargeteScan数据库检索查询miR-155-3p的靶基因可能为CREBRF,并通过相关实验等进一步验证。（8）IL-6和miR-155-3p上调巨噬细胞自噬水平激活STAT3通路促进其M2型极化QRT-PCR、流式细胞术和ELISA结果均显示IL-6和miR-155-3p能够诱导巨噬细胞的M2型极化,同时3-MA处理组miR-155-3p的作用被完全抑制,而IL-6的作用仅被不完全抑制,S3I-201处理组IL-6和miR-155-3p的作用均被完全抑制。（9）过表达IL-6和miR-155-3p的巨噬细胞能够促进胶质瘤恶性进展体外及体内实验结果显示胶质瘤细胞和过表达IL-6或miR-155-3p的巨噬细胞共注射组的实验鼠肿瘤的恶性程度更高。4.结论（1）低氧胶质瘤外泌体传递IL-6和miR-155-3p通过IL-6/pSTAT3/miR-155-3p/自噬/pSTAT3正反馈环诱导巨噬细胞M2型极化,促进胶质瘤恶性进展。（2）IL-6和miR-155-3p可能是治疗胶质瘤潜在的生物标志物,靶向自噬和STAT3通路的治疗可能会逆转胶质瘤抑制性免疫微环境,继而发挥肿瘤相关治疗作用。