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孢子丝菌病(Sporotrichosis)是一种累及皮肤、皮下组织甚至内脏、骨骼等器官的深部真菌感染,病程迁延不愈,严重者可危及生命。我国东北尤其是吉林省是较为严重的流行区域之一。该病病原体为申克孢子丝菌复合体,目前已发现该复合体含7种基因型,其中主要的致病型为3种:申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌及球形孢子丝菌,而我国的流行株以球形孢子丝菌(Sporothrix globosa)为主,且目前为止,球形孢子丝菌是我国东北地区发现的唯一基因型。但目前对于孢子丝菌病的发病机制尚未能完全明确,尤其明确其基因型的差别以后,对于我国的流行菌种球形孢子丝菌的研究极少。孢子丝菌属暗色真菌,具备合成黑素的能力,黑素是其重要的毒力因子之一,但在孢子丝菌方面的相关研究不多。为初步明确人体在感染孢子丝菌后局部的免疫应答状态、球形孢子丝菌诱发巨噬细胞免疫应答的机制以及黑素在其中的作用,本研究对吉林省孢子丝菌病患者的皮损组织进行了免疫组化及蛋白研究,体外采用球形孢子丝菌野生菌株及使用紫外线诱变法获得的相应白化菌株,研究二者刺激THP-1巨噬细胞后发生的免疫应答及其差别,并进一步探索了球形孢子丝菌诱导THP-1巨噬细胞发生免疫应答的分子调控机制。本研究第一部分收集了15例吉林省孢子丝菌病患者的皮损,与3例正常皮肤进行对照研究,对组织进行了84个真菌感染相关基因的q PCR array检测,发现孢子丝菌病患者皮损内表达增高的基因有5个,分别是STAT1、TLR2、LYN、MYD88、PYCARD;表达降低的基因有17个,分别是IL-12β、FOS、TLR9、CHIA、MBL2、IL-2、COLEC12、NPTX1、C5AR1、IL-12α、CSF2、TIRAP、IKBKB、IL-10、CARD9、IL-23α、MAPK8。经过免疫组化研究显示皮损组织内IFN-γ、TNF-α、IL-18表达增高,与正常皮肤比较有显著性差异(p<0.01),其中IFN-γ主要在表皮表达;皮损组织内IL-1β、IL-4、IL-10未见明显表达,其中IL-1β表达与正常皮肤组织比较无统计学差异(p=0.250),正常皮肤组织内可见IL-4、IL-10表达,与皮损组织比较有显著性差异(p<0.01)。对皮损组织的蛋白进行免疫印迹分析发现孢子丝菌病患者皮损组织TLR2表达较正常皮肤增高,而TLR4及NLRP3表达未见明显变化。说明孢子丝菌患者皮损内以Th1方向炎症反应为主,TLR2可能是介导其免疫应答的重要模式识别受体。第二部分进行了体外试验,采用的菌株经过CAL基因测序证实为球形孢子丝菌,并且该菌株序列已上传至Gen Bank(登陆号为KT008664)。利用紫外线诱变法得到了稳定的白化突变株(MEL-),白化株不产黑素,其他性状与野生菌株(MEL+)高度相似。将MEL+、MEL-分别与THP-1巨噬细胞共培养,采用免疫荧光染色、ELISA、流式细胞术、q PCR、western blot等方法,检测THP-1巨噬细胞被菌株刺激后的免疫应答反应及模式识别受体表达情况。结果表明体外培养THP-1巨噬细胞能够吞噬球形孢子丝菌分生孢子,吞噬指数随共培养时间延长而增加,MEL+与MEL-相比较,THP-1巨噬细胞对MEL-吞噬指数大于MEL+,共培养4h时,二者吞噬指数具有显著性差异(p<0.05)。裂解吞噬了分生孢子的THP-1巨噬细胞后,将释放的孢子悬液接种SDA平板培养基,28℃培养7日后MEL+菌株可见多数菌落生长,而MEL-菌株几无生长;且MEL+菌株随共培养时间延长,菌落数量逐渐减少,说明随共培养时间延长,THP-1巨噬细胞对MEL+菌株杀伤孢子能力增强;而THP-1巨噬细胞对MEL-菌株的杀伤作用明显强于MEL+菌株。将MEL+、MEL-以及从野生株提纯出黑素颗粒分别与THP-1巨噬细胞共培养,检测THP-1巨噬细胞释放NO及ROS的水平,结果表明球形孢子丝菌分生孢子可刺激THP-1巨噬细胞释放NO及ROS,且NO释放水平随共孵育时间延长而增加,在共孵育4h时,MEL-组NO及ROS水平均显著高于MEL+组。检测球形孢子丝菌分生孢子刺激THP-1巨噬细胞分泌细胞因子的水平,结果表明THP-1巨噬细胞与MEL+分生孢子共孵育2h时,IL-6及IL-18水平显著性增高,但3h及4h时IL-18水平无显著性差异;4h时TNF-α水平显著性增高;但直至4h时IL-1β水平仍无显著性差异。THP-1巨噬细胞与MEL-分生孢子共孵育2h时,IL-6、IL-1β及IL-18水平均有显著性增高;3h时TNF-α水平也出现显著性增高。3h时,MEL-分生孢子刺激THP-1巨噬细胞分泌TNF-α及IL-18水平高于MEL+分生孢子;4h时,MEL-分生孢子刺激THP-1巨噬细胞分泌四种细胞因子水平均显著高于MEL+分生孢子。而单纯黑素对NO、ROS及细胞因子分泌均无显著性影响。实时荧光定量PCR及免疫蛋白印迹检测THP-1巨噬细胞TLR2、TLR4、NLRP3的表达,结果表明TLR2及TLR4表达增高,且TLR2表达高于TLR4,但NLRP3表达无明显变化。提示我们TLR2在巨噬细胞识别球形孢子丝菌的重要性,而黑素能够抑制THP-1巨噬细胞抵御球形孢子丝菌分生孢子的免疫效能。最后,采用si RNA方法对THP-1细胞进行TLR2分子的敲减,以验证TLR2在THP-1巨噬细胞识别球形孢子丝菌分生孢子及诱发后续炎症反应中的作用。结果表明THP-1巨噬细胞与球形孢子丝菌分生孢子共孵育4小时后,正常THP-1巨噬细胞对球形孢子丝菌分生孢子的吞噬指数为30.01±5.32,TLR2敲减的THP-1巨噬细胞对球形孢子丝菌分生孢子的吞噬指数为6.09±1.62,较正常组明显降低(p=0.00174);正常THP-1巨噬细胞分泌TNF-α为(2475.93±245.12)pg/ml,IL-6为(743.75±55.34)pg/ml,较空白对照组显著性增高(p均<0.01),而TLR2敲减的THP-1巨噬细胞分泌TNF-α为(1476.18±313.79)pg/ml,IL-6为(452.65±29.93)pg/ml,较空白对照组无显著性变化(p=0.951及0.068)。说明TLR2分子在识别以及介导分泌炎症因子以抵御球形孢子丝菌感染的过程中具有重要作用。本研究初步发现了孢子丝菌患者皮损内的免疫状态及差异表达基因,体外试验进一步阐明了黑素作为球形孢子丝菌的重要的毒力因子在抑制宿主免疫应答中的作用,确证了TLR2是宿主识别球形孢子丝菌的重要受体,为明确孢子丝菌病的发病机制提供了新的理论基础。