Endostatin、bFGF、CD34在胆囊癌中表达及意义的实验研究前言胆囊癌是胆道系统常见的恶性肿瘤，其发病率约占胆囊切除病人的0.54％～1.77％。由于胆囊癌早期诊断困难，临床病人多为晚期，手术切除率低，术后5年生存率徘徊在2％～3％的低水平。在胆囊癌的综合治疗中，对新的抗肿瘤药物的研究和探索一直是胆囊癌治疗的热点问题。肿瘤的发生、发展和转移依赖于肿瘤血管形成，只有在新生血管形成以后，肿瘤才能迅速长大，并进一步向周围浸润和进入血液循环向远处转移。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)具有强有力的促血管生成作用，大量研究表明，bFGF具有促进细胞有丝分裂和诱导新血管生成的作用，与肿瘤的分化、浸润、生长、转移和肿瘤新血管的生成有密切的关系。血管生成是一个多因素调控，多步骤的过程，该过程受到“血管生成开关”系统的精密调控，促使血管生成因子和抗血管生成因子保持平衡。内皮抑素(Endostatin)是迄今发现的最为理想的血管生成抑制因子，能够抑制肿瘤血管生成和肿瘤转移，促使肿瘤细胞凋亡，且不产生耐药性，毒副作用轻。20世纪70年代初，Folkman等首先提出恶性肿瘤生长和转移依赖于肿瘤新生血管的假设，并提出了通过抑制血管成长、切断营养供给来抑制肿瘤生长的设想，由此开创了肿瘤血管形成和血管靶向治疗的研究。现在Folkman的这种假设已经被绝大多数实验证据所证实。目前认为endostatin是最广谱低毒的血管生成抑制因子之一，可抑制65种不同肿瘤，下调病理性的血管生成，并且无副作用。微血管密度(MVD)是衡量血管生成的定量指标，可通过计算CD34表达情况来表示，MVD可作为恶性肿瘤的诊断、预后评估和分层治疗的客观指标。目前，国内外学者对bFGF与胆囊癌关系的报道还不是很多，认为bFGF与胆囊癌肿血管的形成密切相关，能促进肿瘤血管的形成，促进肿瘤的生长，与肿瘤的分期、转移、预后及疗效密切相关。在本实验研究立题时尚未见胆囊癌中Endostatin免疫组化的相关报道。因此，胆囊癌中正负血管调节因子与胆囊癌的关系还是值得深入研究的。目的本课题运用免疫组织化学方法检测胆囊癌手术标本石蜡切片中Endostatin、bFGF及CD34的表达情况，目的在于探讨它们与胆囊癌临床病理参数的关系，以期进一步了解胆囊癌发生、发展的机制，寻求胆囊癌早期诊断及治疗的新途径。实验材料1、实验材料收集61例胆囊癌手术后的石蜡包埋胆囊标本，另取10例正常胆囊组织标本进行对照。2、实验试剂兔抗人Endostatin多克隆抗体(浓缩型)(Neomarkers，美国)，兔抗人bFGF多克隆抗体(浓缩型)(Santa，美国)，鼠抗人CD34单克隆抗体(即用型)、S-P试剂盒(包括：A．过氧化物酶阻断剂B．正常动物非免疫血清C．生物素标记的第二抗体D．链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液F．DAB kit显色剂)和阳性切片(福州迈新生物技术开发有限公司)。3、主要实验仪器(1)萤光倒置显微镜(Olympus ix 51，日本)(2)显微图像采集CCD(Olympus DP 71，日本)实验方法1、免疫组化采用我院病理科常规S-P免疫组化染色方法。3μm厚石蜡切片，脱腊，至水，高温抗原修复，0.3％过氧化氢甲醇液，阻断内源性过氧化酶活性，5％正常非免疫动物血清封闭内源性抗原，滴加一抗和二抗，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明后中性树胶封片。以PBS代替一抗设阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。Endostatin及bFGF蛋白阳性表达计分标准采用的方法：随机选择10个高倍视野共记录1000个胆囊癌细胞，并计算阳性表达细胞百分比，结合染色强度进行评分，以两者乘积为最后得分：0～3分为阴性(—)，3～6分为弱阳性(+)，6-9分为阳性(++)，大于9分为强阳性(+++)。微血管密度判断：采用CD34抗体标记血管内皮细胞，计数单位面积中的微血管数目，即微血管密度(MVD)，由此来衡量肿瘤血管生成的活跃程度。参照Weidner法先在低倍镜下选取肿瘤微血管数量最丰富的区域，然后在200倍视野范围计算4个视野血管的数目，取其平均值作为MVD。凡染色呈棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇，均作为一个血管计数，而不以红细胞的出现来确定是否是血管，也不以是否出现管腔来计数血管。凡管腔大于8个红细胞大小或管壁有平滑肌组织者不作为微血管计数。2、统计学处理计数资料采用X~2检验和秩和检验；计量资料采用t检验，方差分析及Q检验；统计软件采用SPSS10.0软件。结果1、Endostatin的表达Endostatin在正常胆囊组织，胆囊癌中的阳性表达率分别为40％、77.05％，统计学上有显著差异(P＜0.05)，61例胆囊癌中，Endostatin表达强度与临床分期及淋巴结转移关系密切(P＜0.05)，临床中晚期、有淋巴结转移者表达增强，与性别、年龄、肿瘤部位、大小及组织学分级无关。2、bFGF的表达bFGF在正常胆囊组织，胆囊癌中的阳性表达率分别为20％、67.21％，统计学上有显著差异(P＜0.05)，61例胆囊癌中，bFGF表达强度与临床分期及淋巴结转移关系密切(P＜0.05)，临床中晚期、有淋巴结转移者表达增强，与性别、年龄、肿瘤部位、大小及组织学分级无关。3、CD34的表达：通过CD34表达计算微血管密度MVD，胆囊癌中MVD均值76.66±20.15，明显高于正常胆囊组织(29.53±5.03)(P＜0.01)，61例胆囊癌中，Nevin分期Ⅲ～Ⅴ期MVD均值80.53±17.98，显著高于Ⅰ-Ⅱ期(46.79±5.38)(P＜0.01)，淋巴结转移组的MVD均值94.60±7.28，显著高于未发生淋巴结转移组(58.12±9.24)(P＜0.01)，组织学分级G1组60.59±14.71、G2组83.08±15.30、G3组96.53±6.92，组间差异明显(P＜0.01)，与性别、年龄、肿瘤部位及大小无关。4、胆囊癌组织中Endostatin、bFGF的表达与MVD的关系：Endostain的表达与MVD关系密切(P＜0.01)，bFGF的表达与MVD关系密切(P＜0.01)，Endostatin与bFGF的表达未发现相关性(P＞0.05)。讨论在正常组织中，促血管形成因子与抗血管形成因子均衡时，血管处于静止状态，称为休眠。肿瘤发生后，促血管形成因子增多而抗血管形成因子相应减少，导致血管增生，从而使肿瘤组织得以增生并发生转移。促血管形成因子bFGF和抗血管形成因子Endostatin在胆囊癌中的表达及相互作用情况如何，国内外尚无相关报道。本研究运用免疫组化方法检测Endostatin和bFGF在胆囊癌中的表达，并以MVD(通过CD34表达表示)作为血管生成的客观定量指标，以期寻找二者与血管生成的关系。实验证明Endostatin表达与MVD、bFGF表达与MVD关系密切，二者在胆囊癌的发生发展过程中的作用是显而易见的。结论1、Endostain及bFGF表达、MVD在胆囊癌中均显著高于正常胆囊组织，在胆囊癌的发生和发展中起一定的作用。2、Endostain在胆囊癌中随着临床分期级别的增高和淋巴结转移表达明显增强，Endostain高表达者恶性程度高，浸润性强。3、bFGF在胆囊癌中随着临床分期级别的增高和淋巴结转移表达明显增强，bFGF高表达者恶性程度高，浸润性强。4、MVD在胆囊癌中随着临床分期级别的增高、淋巴结转移及组织学分级的增高而明显增多，MVD高者肿瘤新生血管丰富，恶性程度高。5、Endostain的表达与MVD关系密切，bFGF的表达与MVD关系密切，提示血管生成刺激因子和抑制因子对血管生成起重要作用。Endostatin与bFGF的表达未发现相关性，提示Endostatin的抗血管生成作用可能并非通过与bFGF竞争受体而来，而是有其独立的机制。