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第一部分小鼠神经元深低温低氧细胞模型的建立目的建立一种小鼠原代神经元深低温低氧细胞模型。方法选用健康清洁级C57BL/6小鼠乳鼠(出生后48h内),断头取脑,取大脑皮层神经元,经纯化培养成稳定细胞系。置于深低温(18.5±0.5℃)、低糖(DMEM-LG培养基),低氧(95%N2,5%CO2)下培养24h,然后更换培养基,于37℃、95%空气、5%CO2培养箱中培养24h,建立深低温低氧细胞模型。结果细胞形态学:正常情况下的皮层神经元,其胞体比较大,树突与轴突光镜下明显可见,且联系紧密。经历模拟DHLF过程的深低温低氧缺血再灌注过后,贴壁的皮层神经元数量减少,胞体缩小,且形状不规则,轴突明显增多,神经元之间的突起联系不佳。成功构建了小鼠深低温低氧脑缺血再灌注细胞模型。结论小鼠深低温低氧脑缺血再灌注细胞模型的建立有利于课题组后期体外实验的开展,具有重要的意义。第二部分miR-7在小鼠神经元深低温低氧细胞模型中的保护作用及分子机制目的研究微小RNA(miRNA,miR-7)在小鼠深低温低氧缺血再灌注细胞模型中的保护作用和分子机制。方法通过已建立的小鼠深低温低氧缺血再灌注细胞模型,以及N2a细胞系模型,分别加入miR-7agomir、miR-7antagomir和人工脑脊液,构建agomir组、antagomir组和对照组。对各组进行形态学观察,qt-PCR检测miR-7表达,ELISA检测LDH漏出情况,流式细胞学检测凋亡并使用WB技术进一步检测其下游蛋白的表达。结果qt-PCR结果提示两种细胞系agomir组较之于对照组miR-7浓度明显升高、antagomir组则明显降低;光镜下观察提示,原代细胞系与N2a细胞系,经历深低温低氧过程后agomir组较之于对照组细胞形态保持较好,贴壁数量多,细胞状态好,antagomir组细胞形态较差,状态不佳;ELISA结果表明两种细胞系agomir组的LDH漏出情况较之于对照组miR-7低、antagomir组则明显升高;进行流式细胞学检测,两种细胞系中,agomir组较之于对照组凋亡及坏死数量明显减少、antagomir组则大量出现凋亡及坏死情况;Western blot结果提示:两种细胞系agomir组较之于对照组p-Akt以及Bcl-2表达明显上调,Bax表达明显下调,而antagomir组则与之相反;结论miR-7可以有效改善深低温低氧过程后的细胞损伤,起到保护作用;其保护作用可能是通过激活PI3K/Akt信号通路进而发挥其作用。