第一部分 中枢组胺通过早期抑制脊髓背角小胶质细胞激活减轻PSL诱导的神经病理性疼痛众所周知,组胺参与调节机体痛觉的感知过程。但是,组胺对神经病理性疼痛的作用还缺乏系统的研究。本课题研究了组胺,以及组胺H3受体拮抗剂对坐骨神经部分性结扎(Partial sciatic nerve ligation, PSL)诱导的二型复杂性区域疼痛综合征(Complex regional pain syndrome-2, CRPS-2)中神经病理性疼痛(Neuropathic pain, NP)的作用。我们采用腹腔内注射组胺的前体物质组氨酸提高中枢神经系统中的组胺含量。结果发现,PSL手术后立即腹腔内注射组氨酸,一天给予一次,连续3天,7天或者14天,都可以有效地抑制大鼠同侧后爪因PSL引起的机械痛觉超敏和热痛觉过敏。如果造模后没有立即给药,而在术后2-3天,4-7天或者8-14天连续给药,组胺酸对大鼠的机械痛过敏和热痛超敏都没有影响。形态学和免疫印迹结果发现,术后立即给予组氨酸可以抑制大鼠腰部脊髓背角因PSL手术诱导发生的小胶质细胞的激活和白介素1β(IL-1β)表达的上升,这与行为学实验结果一致。鞘内注射10 ng IL-1β可以完全拮抗组氨酸的镇痛作用,而在IL-1受体基因敲除(IL-1R-/-)小鼠,组氨酸既不能抑制异常疼痛,也不能抑制脊髓背角小胶质细胞的激活。为了研究组氨酸的镇痛作用是否是通过转化成组胺后实现的,我们首先测量了组氨酸腹腔内注射7天后脊髓组胺的含量变化,结果发现组氨酸100mg/kg可以显著上调腰髓和延髓的组胺水平。其次,在组氨酸脱羧酶基因敲除(HDC-/-)小鼠以及用HDC抑制剂α-FMH处理的小鼠,组氨酸的镇痛作用消失,同时组氨酸对脊髓背角小胶质细胞的激活的抑制作用在HDC-/-小鼠上也消失了。不仅如此,单独鞘内注射组胺(100,200ng/rat)也可以抑制大鼠同侧后爪热痛觉过敏。这些结果都提示,组氨酸是通过转化为组胺发挥镇痛作用。为了进一步探讨介导组胺的作用机制,我们观察了H1,H2受体拮抗剂对组氨酸镇痛作用的影响。H1受体拮抗剂mepyramine (200 ng/rat, i.t.)可以完全阻断组氨酸的镇痛以及对小胶质细胞激活的抑制作用,H2受体拮抗剂cimetidine (200,500 ng/rat, i.t.)却没有作用。我们的结果提示,中枢组胺具有抑制PSL诱导的CRPS-2中神经病理性疼痛的作用,这种作用与其通过组胺H1受体抑制脊髓背角小胶质细胞的激活以及IL-1β的生成有关。第二部分 组胺H3受体拮抗剂通过上调蓝斑神经元兴奋性突触传递功能抑制PSL诱导的神经病理性疼痛第一部分的实验结果表明中枢组胺对神经损伤引起的CRPS-2的神经病理性疼痛具有抑制作用。然而,一方面外源性组胺本身非常不稳定,又不能够透过血脑屏障,而且直接中枢给药的方式在临床上也很难实现。另一方面,外源性组胺激活H1、H2受体还与外周炎症反应和胃酸分泌等各项生理学功能密切相关。另外,从第一部分的实验结果也可以看到,组氨酸的镇痛作用具有早期时程依赖性,用药“时间窗”较窄。这都限制了组胺作为药物在临床上的应用。因此,有必要寻找相应的组胺能神经的药物。目前,组胺H3受体拮抗剂成为研究和开发组胺相关药物的热点,因为它既能增加神经元合成,又能增加组胺的释放。首先,我们在PSL手术小鼠上给予不同剂量的H3受体拮抗剂thioperamide (5 μg,15μg,30μg/mice, i.c.v.),连续给药7天,观察thioperamide的作用。结果发现,thioperamide可以剂量依赖地抑制小鼠双侧后爪机械痛觉超敏和同侧后爪热痛觉过敏。Thioperamide (30 μg/mice, i.c.v.)还可以抑制对侧后爪的热痛觉过敏。Thioperamide的镇痛作用可以被H3受体特异性激动剂immepip逆转,而单独使用immepip对小鼠后爪异常疼痛没有影响。为了证明thioperamide的作用与拮抗H3受体有关,我们观察了另一种H3受体拮抗剂clobenpropit的作用,结果发现连续7天给予clobenpropit (30 μg/mice, i.c.v.)也可以抑制小鼠双侧后爪机械痛觉超敏和热痛觉过敏。在PSL手术后7-14天给予thioperamide (30 μg/mice, i.c.v.)仍然可以抑制小鼠双侧后爪机械痛觉超敏和热痛觉过敏。Thioperamide (30 μig/mice,i.c.v.)术后第7天单次给药,在给药后20 min,可以抑制小鼠对侧后爪的热痛觉过敏,而给药后40 min,可以抑制小鼠双侧后爪的机械痛觉超敏和热痛觉过敏。进一步实验发现,H3受体基因敲除(H3R-/-)可以抑制PSL手术诱导产生的异常痛觉反应,而在H3R-/-小鼠身上观察不到thioperamide的镇痛作用。出乎意料的结果是,thioperamide的镇痛作用不能被HDC的抑制剂α-FMH、H1受体拮抗剂mepyramine和H2受体拮抗剂cimetidine所逆转,而在HDC-/-小鼠,thioperamide仍然具有镇痛作用。这些结果提示thioperamide的镇痛作用可能不依赖脑内的组胺的作用。有文献报道,thioperamide对脑内去甲肾上腺素系统有调节作用,因此我们在离体脑片上观察了PSL后蓝斑神经元放电的变化及thioperamide的作用,结果发现,PSL手术后,蓝斑神经元自发动作电位频率下降,thioperamide(10μM)对自发动作电位频率影响不大,但是可以显著增加PSL手术后蓝斑神经元的兴奋性突触后电位(sEPSC)的频率,对其幅度影响不大。以上结果提示,H3受体拮抗剂能抑制PSL手术诱发的神经病理性疼痛,其机制可能与增加蓝斑神经元兴奋性突触传递功能有关。