在骨骼肌损伤修复的过程中,TGFβ是影响骨骼肌纤维化的主要细胞因子。研究发现,它不仅引起损伤骨骼肌纤维化,在肺、肾、肝、皮肤的纤维化过程中也发挥关键性作用。而TGFβ的纤维化作用主要通过TGFβ-Smad信号通路来进行调控。Smad4作为Smad蛋白家族中唯一的辅助转运蛋白,是TGFβ-Smad信号通路中的关键蛋白。本课题研究目的是应用RNA干扰技术抑制Smad4在小鼠骨骼肌损伤部位的表达,阻断TGFβ-Smad信号通路的传导,进而达到抑制骨骼肌损伤后纤维化,促进损伤愈合的作用。我们首先构建以慢病毒为载体的Smad4siRNA,在体外验证能够抑制C2C12成肌细胞的Smad4基因及蛋白表达,再将以慢病毒为载体的Smad4RNA干扰片断采用局部注射的方式植入小鼠体内,发现在局部注射部位能够长期发挥抑(?)Smad4基因表达,降低Smad4蛋白分泌,阻断TGFβ-Smad信号转导的作用。我们最后发现,注射慢病毒介导的Smad4-siRNA可最终抑制小鼠损伤骨骼肌纤维化的形成,减轻疤痕的产生,并进一步改善骨骼肌收缩功能,促进骨骼肌损伤愈合。第一部分以慢病毒为载体的Smad4siRNA的构建与鉴定目的构建并鉴定以慢病毒为载体的Smad4小RNA干扰片段。方法根据Smad4的基因信息,使用不同的在线si RNA序列设计软件,设计五条针对目的基因CDS区的si RNA序列以及一条乱序RNA序列作为对照。根据每条si RNA序列,设计两条互补的DNA模板单链,合成相应的DNA单链。将DNA单链退火,与si RNA质粒表达载体(pSIHl-H1-copGFP shRNA Vector)连接后进行PCR鉴定,并将质粒进行测序。选取siRNA1、siRNA2、siRNA3三条序列进行下一步研究。将构建成功的重组表达载体进行去内毒素质粒DNA抽提,使用siRNA表达载体质粒DNA转染NIH3T3细胞,观察病毒转染效率。采用Real-time PCR和Western blot的方法检测基因干预后NIH3T3细胞中smad4基因和蛋白的表达情况。选取siRNAl进行下一步研究。将siRNAl转染293T细胞,测定病毒滴度,并进行慢病毒颗粒的包装和生产。结果成功构建出3条Smad4siRNA, PCR鉴定5条克隆均为阳性克隆,并经DNA测序,发现与设计序列完全吻合。将3条Smad4siRNA及一条作为对照的Negative siRNA转染NIH3T3细胞后,在荧光显微镜下观察转染效率,以绿色荧光做为参照,计算出转染NIH3T3细胞的效率大约为75%,基本能够满足实验要求。Real-time PCR和Western blot检测发现与对照组相比,3条siRNA均能抑制NIH3T3细胞中smad4的基因与蛋白表达(P<0.05),其中又以siRNA1的基因沉默效率最高,可达到80%以上。选取siRNA1进行下一步研究。将siRNA成功转染293T细胞并生产出病毒液后,使用dPBS将病毒颗粒浓度调整至：1×104ifu/μl,-70℃保存病毒液,待用。结论成功构建出Smad4siRNA序列,发现能有效抑制NIH3T3细胞内Smad4基因及蛋白的表达,有利于实验进一步开展。第二部分以慢病毒为载体的Smad4siRNA转染C2C12成肌细胞及抑制Smad4表达的作用目的了解以慢病毒为载体的Smad4siRNA体外转染C2C12成肌细胞的效率及抑制C2C12细胞Smad4基因及蛋白表达的能力。方法将病毒液转染C2C12成肌细胞,培养72小时后在倒置荧光显微镜下观察转染情况,并用胰酶消化后对细胞进行计数,计算出感染的最佳MOI值。使用流式细胞仪进一步验证转染效率,计算感染的最佳MOI值。采用Real Time-PCR和Western blot方法检测病毒转染C2C12C成肌细胞后Smad4基因和蛋白的表达情况。结果慢病毒介导的Smad4-siRNA体外转染C2C12成肌细胞后,荧光显微镜下计数及流式细胞仪检测均证实MOI值为6时细胞转染效率最高,可达99%以上,同时并不影响细胞生长。Real Time-PCR和Western blot检测发现,C2C12细胞培养3代后,Smad4-siRNA仍然能够有效沉默Smad4基因和蛋白的表达,沉默效率在85%以上。结论以慢病毒为载体的Smad4siRNA可成功转染体外C2C12成肌细胞,并能有效抑制Smad4基因及蛋白的表达。第三部分以慢病毒为载体的Smad4siRNA在体转染小鼠急性钝挫伤骨骼肌及抑制Smad4表达的作用目的了解以慢病毒为载体的Smad4siRNA转染小鼠急性钝挫伤骨骼肌的效率及抑制钝挫伤骨骼肌Smad4基因及蛋白表达的能力。方法用自制打击装置将72只g雌性C57bl小鼠(体重20-25)右侧腓肠肌中段造成急性钝挫伤模型,随机分为三组(每组24只),包括：①PBS对照组；②Lv siRNA注射组；③LvNegative注射组。小鼠打击伤后10d,分别在损伤部位注射PBS0.1ml、Lv siRNA(浓度1×106ifu/μl)、LvNegative(浓度1×106ifu/μl)。分别于伤后第7、14、21、28d,各组随机抽取6只小鼠处死取材。荧光显微镜下观察局部GFP表达情况。将损伤部位骨骼肌及心脏、肝脏、肾脏、脑组织取材行Real Time-PCR(?)Western blot检(?)Smad4基因和蛋白的表达情况,进一步了解Smad4-siRNA在小鼠体内抑带Smad4表达的情况。结果以慢病毒为载体的Smad4-siRNA注射至损伤小鼠骨骼肌局部后,在LvNegative注射组和Lv siRNA注射组小鼠损伤骨骼肌部位均可检测到GFP表达,在Lv siRNA注射组的肝脏、心脏、肾脏及脑组织内并未检测到GFP表达,Real Time-PCR和Western blot检测发现,以慢病毒为载体的Smad4-siRNA能够有效抑制小鼠体内损伤部位骨骼肌Smad4基因和蛋白的表达,并不影响肝脏、心脏、肾脏及脑组织的Smad4基因和蛋白的表达,表明采用慢病毒局部注射的方法能够成功将目的基因转染小鼠损伤局部的骨骼肌细胞,并在注射部位稳定表达转基因产物,但并不会远处转染其他脏器。。结论以慢病毒为载体的Smad4siRNA能够成功转染小鼠急性钝挫伤骨骼肌,病毒并未转染全身其他组织。采用慢病毒局部注射的方法能够成功将目的基因转染小鼠损伤局部的骨骼肌细胞,并可长期发挥抑制Smad4基因及蛋白的表达,但并不影响其他组织Smad4基因及蛋白的表达,是一种安全有效的方法。第四部分慢病毒介导的Smad4基因沉默对小鼠损伤骨骼肌纤维化及愈合质量的影响目的了解以慢病毒为载体的Smad4siRNA转染小鼠急性钝挫伤骨骼肌后抑制骨骼肌纤维化、减轻疤痕生成,促进骨骼肌损伤修复的能力。方法用自制打击装置将72只g雌性C57b1小鼠(体重20～25)右侧腓肠肌中段造成急性钝挫伤模型,随机分为三组(每组24只),包括：①PBS对照组；②Lv siRNA注射组；③LvNegative注射组。小鼠打击伤后10d,分别在损伤部位注射PBS0.1ml、Lv siRNA(浓度1×106ifu/μl)、LvNegative(浓度1×106ifu/μl)。分别于伤后第7、14、21、28d,各组随机抽取6只小鼠处死取材。将损伤部位骨骼肌取材行Masson染色以及Vimentin和αSMA免疫组化检测,和Vimentin,α SMA、I型胶原的Western-Blot检测,了解各组小鼠急性钝挫伤后腓肠肌局部纤维化情况,最后生物力学检测各组小鼠骨骼肌的强直收缩和快速颤搐收缩能力,了解小鼠损伤骨骼肌愈合情况。结果小鼠骨骼肌急性钝挫伤后14、21、28天,Masson染色发现,Lv siRNA注射组骨骼肌疤痕生成明显低于Lv Negative注射组和PBS对照组,差异具有统计学意义。免疫组化及Western blot检测也发现,小鼠骨骼肌急性钝挫伤后14、21、28天,代表骨骼肌纤维化程度的vimentin、α SMA和I型胶原纤维表达在Lv siRNA注射组均明显低于对照组和Lv Negative注射组。表明局部注射Smad4-siRNA慢病毒液可明显抑制骨骼肌急性损伤后纤维化的发生,减轻疤痕生成。生物力学检测也发现,在急性钝挫伤后21天及28天,Lv Smad4注射组小鼠腓肠肌的强直收缩和快速颤搐收缩要明显高于PBS对照组和Lv Negative注射组,差异具有统计学意义,表明Smad4-siRNA注射组骨骼肌愈合质量优于对照组和Lv Negative组。结论以慢病毒为载体的Smad4siRNA局部注射至小鼠急性钝挫伤骨骼肌后能够抑制骨骼肌纤维化的发生、减轻疤痕生成,并改善骨骼肌损伤后的愈合质量,促进骨骼肌损伤修复。