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沙门氏菌能引起家禽患病,对家禽养殖业有严重的危害,带菌的禽蛋禽肉也会通过食物链引起人的食源性疾病。预防和减少家禽沙门氏菌感染可以改善家禽健康并减少人类沙门氏菌相关疾病。目前针对沙门氏菌的治疗多采用抗生素,随着多重耐药性菌株的出现,增加了沙门氏菌治疗的难度,有必要寻找新的防控措施。外膜囊泡（Outer membrane vesicles OMVs）能够刺激宿主固有免疫细胞,增强宿主免疫和减少病原菌的感染。沙门氏菌分泌的OMVs有减少家禽沙门氏菌感染强度的能力,但是机制还不清楚。巨噬细胞和单核细胞是参与固有免疫反应重要的单核吞噬细胞,然而沙门氏菌OMVs对鸡单核吞噬细胞免疫激活的作用和机制尚不清楚。鉴于此,本研究首先分离鸡源沙门氏菌的OMVs,探究OMVs本身及包含的脂多糖（Lipopolysaccharide LPS）和蛋白质对鸡巨噬细胞样HD11细胞和单核细胞的免疫激活作用,最后利用蛋白质质谱技术进一步分析OMVs蛋白质组成。本研究为沙门氏菌外膜囊泡作为鸡潜在免疫激活剂发挥作用提供数据支持。试验结果如下:1.鸡源沙门氏菌外膜囊泡的分离纯化及表征分析。试验首先选取沙门氏菌CVCC542、（Salmonella SAL）SAL A、SAL B三株菌进行OMVs提取,发现OMVs数量随着培养时间增加而增加,试验条件选取培养时间12 h和培养体积2 L的沙门氏菌提取OMVs满足后续试验需求。密度梯度离心显示在25%离心层,OMVs数量最多。激光纳米颗粒分析仪显示OMVs粒径范围在50-300 nm,粒径峰值在126 nm,扫描电镜SEM和透射电镜TEM也显示OMVs粒径在100 nm左右。通过试剂盒检测CVCC542、SAL A和SAL B来源的OMVs蛋白浓度分别为1342.15、1365.62和1726.46μg/1012 particles,脂多糖浓度分别为1038.19、958.49和1211.96μg/1012 particles,每μg蛋白对应的脂多糖含量分别为0.78μg、0.71μg和0.73μg。结果表明成功分离得到沙门氏菌的OMVs。2.沙门氏菌外膜囊泡对鸡单核细胞及HD11细胞的免疫激活。本部分试验研究鸡源鼠伤寒沙门氏菌CVCC542外膜囊泡对鸡骨髓源单核细胞和HD11吞噬作用的影响。相比PBS（对照组）,阳性对照组200 ng/m L LPS和含有200 ng/m L LPS的OMVs组均能促进鸡骨髓源单核细胞和HD11树突的形成,促进LITAF、IL-6和i NOS m RNA表达,表明沙门氏菌OMVs激活骨髓源单核吞噬细胞和鸡巨噬细胞。吞噬试验显示OMVs能够增强HD11对FITC-Dextran和FITC-Salmonella的吞噬作用。菌落形成单位结果也显示OMVs刺激HD11激活后吞噬细菌更多。此外,HD11细胞摄取OMVs试验也显示,OMVs和HD11共孵育8 h、16 h和24 h后,都可以被HD11摄取。本章试验表明OMVs能够进入HD11细胞,并能够激活鸡骨髓源单核吞噬细胞和鸡巨噬细胞,加强HD11细胞吞噬活性。3.抑制沙门氏菌外膜囊泡中LPS和蛋白质对鸡单核吞噬细胞激活的影响。本试验的目的是检测OMVs携带的LPS和蛋白质对鸡巨噬细胞和单核细胞分化和吞噬功能的影响。本章研究将沙门氏菌OMVs经过多粘菌素（Polymyxin B,PMB）和蛋白酶K（Proteinase K,PK）处理,观察处理后的OMVs对HD11细胞及脾脏单核细胞的炎性因子刺激能力和吞噬作用,结果发现两种处理能够降低HD11细胞和脾脏单核细胞对FITC-Salmonella的吞噬作用和降低IL-1β、LITAF和IL-6炎性因子的分泌。此外,定量PCR检测OMVs处理可以增强HD11细胞TLR2和TLR4的表达增强。这些结果表明抑制沙门氏菌OMVs脂多糖和蛋白影响鸡巨噬细胞和脾脏单核细胞的免疫激活。4.沙门氏菌外膜囊泡蛋白质组成分析。OMVs蛋白质也参与激活鸡免疫细胞,那么OMVs主要蛋白有哪些,蛋白酶K处理OMVs前后蛋白质变化如何。本章试验采用液相色谱-质谱联用技术对沙门氏菌OMVs的蛋白质成分进行分析,共鉴定出251种蛋白质。使用Cell-PLoc-2进行蛋白质的亚细胞结构预测,在蛋白酶K未处理的OMVs蛋白质中,位于细胞质、内膜、内膜细胞质均有、胞外、细胞周质、外膜和未知蛋白质个数（所占百分比%）分别为99（43%）、42（18%）、32（14%）、23（10%）、13（6%）、12（5%）和9（4%）。在蛋白酶K处理的OMVs蛋白质中位于外膜、细胞质、内膜和胞质中均有、细胞周质中蛋白个数（所占百分比%）分别为12（28%）、10（23%）、10（23%）、10（23%）和1（3%）。根据Uni Prot中的GO分析,蛋白酶K未处理的OMVs蛋白质主要被分类为细胞组分代谢、转运活性和细胞结构。蛋白酶K处理的OMVs蛋白质主要被分类为转运活性、细胞组分代谢、蛋白质折叠和降解。试验结果表明OMVs中鞭毛蛋白被蛋白酶K降解,OMVs选择性保护外膜蛋白Omp A、Omp D、Omp F和膜脂蛋白Lpp等不被蛋白酶K降解。综上所述,本研究从鸡源沙门氏菌成功分离得到外膜囊泡OMVs,携带丰富的LPS和蛋白等MAMPs,纳米结构容易被单核吞噬细胞内在化,不会体外增殖相对安全,能通过脂多糖和蛋白激活鸡单核吞噬细胞并增强其对细菌的吞噬功能,有作为鸡免疫激活剂的潜力。这为预防沙门氏菌对鸡的危害、家禽健康养殖及人类健康有重要的意义。