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甲型流感病毒（Influenza A virus）属于正黏病毒科,流感病毒属。作为负链RNA病毒,具有易突变的特性。流感病毒RNA聚合酶,核蛋白以及病毒基因组组成核糖核蛋白复合体,是病毒基因转录与复制的最基本单元,蛋白的翻译后修饰在病毒的生命周期中起着非常重要的作用。HDAC6作为组蛋白去乙酰化酶,能够通过调控微管蛋白的细胞骨架,介导抗病毒免疫应答或者直接调控病毒蛋白参与各种病毒的生命周期。因此本研究从流感病毒与宿主蛋白HDAC6的互作出发,发现了流感病毒RNA聚合酶复合体PA蛋白的乙酰化修饰对聚合酶活性乃至病毒基因复制与转录的影响,为研究蛋白修饰对流感病毒以及其它病毒RNA聚合酶的调节作用提供参考。1.HDAC6与流感病毒RNA聚合酶相互作用流感病毒利用宿主细胞内的营养物质以及通过劫持宿主蛋白来维持自身的生命活动。宿主蛋白HDAC6通过调控微管蛋白的乙酰化状态抑制流感病毒蛋白的运输,而流感病毒则利用HDAC6介导的聚集体的形成促进自身的脱壳过程,在此过程中,基质蛋白M1,核蛋白NP能与HDAC6相互作用。而核蛋白NP与RNA聚合酶复合体紧密联系在一起,所以本研究通过免疫共沉淀,GST pull-down以及共聚焦免疫荧光试验检测HDAC6与流感病毒RNA聚合酶的互作关系。结果显示,HDAC6能与病毒蛋白PA、PB1、PB2和NP互作,并且HDAC6能够通过介导蛋白酶体使PA的蛋白水平下降,而对其他病毒蛋白则没有影响。GST pull-down试验则发现HDAC6能与PA蛋白直接结合。最后通过共聚焦免疫荧光试验,发现HDAC6与PA能共定位于细胞质。综上所述,HDAC6能与病毒蛋白PA相互作用,并调节PA的蛋白表达。2.HDAC6介导PA蛋白的去乙酰化从而影响其蛋白稳定性HDAC6作为组蛋白去乙酰化酶,参与多种病毒的复制周期。本研究从HDAC6的去乙酰化酶活性出发,挖掘HDAC6与PA蛋白的互作机制。发现病毒蛋白PA过表达的情况下,使用HDAC6特异性抑制剂Tubacin以及广谱抑制剂TSA抑制其去乙酰化酶活性,PA的蛋白水平上调,而HDAC6活性区域缺陷突变体HDAC6-DM无法下调PA的蛋白水平,说明HDAC6下调PA蛋白依赖于其去乙酰化酶活性。通过质谱分析鉴定,发现PA蛋白664位赖氨酸能被乙酰化和泛素化修饰。而体外去乙酰化试验表明,HDAC6能使PA蛋白664位赖氨酸去乙酰化,并且与其去乙酰化酶活性有关。而PA的蛋白稳定性与其664位赖氨酸的乙酰化修饰有关。综上所述,HDAC6通过使PA蛋白664位赖氨酸去乙酰化,从而影响其蛋白稳定性。3.过表达HDAC6能够抑制流感病毒基因的转录与复制PA、PB1和PB2三种蛋白组成流感病毒RNA聚合酶复合体,介导病毒基因的转录与复制。病毒蛋白PA具有核酸内切酶的活性,对于RNA聚合酶三聚体的形成具有重要的作用,而组蛋白去乙酰化酶HDAC6能够介导PA蛋白的去乙酰化,影响PA的蛋白稳定性。因此本研究在MDCK以及A549细胞中过表达HDAC6蛋白,检测流感病毒的复制情况。通过免疫印迹试验,RT-PCR与荧光定量PCR试验发现流感病毒基因的转录与复制水平均下降,继而通过免疫荧光试验与流式细胞技术发现IAV/GFP（RFP）-HDAC6双阳性细胞个数明显少于IAV/GFP（RFP）双阳性的细胞个数,说明HDAC6对流感病毒的增殖具有抑制作用,并且过表达HDAC6流感病毒滴度也显著降低。综上所述,HDAC6能够通过影响流感病毒基因的转录与复制抑制病毒的增殖。4.抑制HDAC6能促进流感病毒基因的转录与复制为进一步确认HDAC6在流感病毒生命周期中的作用,我们使用HDAC6特异性抑制剂Tubacin检测其对流感病毒的影响,免疫印迹试验,RT-PCR 以及荧光定量PCR试验表明,Tubacin能上调流感病毒基因的转录与复制。同样的,免疫荧光试验以及病毒滴度测定结果也说明Tubacin能促进流感病毒的增殖。使用干扰RNA沉默HDAC6的蛋白表达后,发现流感病毒基因的转录以及复制水平均上调,病毒滴度也得到提高,与抑制剂的结果一致。综上所述,抑制HDAC6的去乙酰化酶活性或沉默HDAC6的蛋白表达能够增强流感病毒基因的转录与复制。5.HDAC6抑制流感病毒RNA聚合酶活性依赖于其去乙酰化酶活性组蛋白去乙酰化酶HDAC6具有两个独立的去乙酰化酶活性区域,能介导α微管蛋白,热休克蛋白90,皮层肌动蛋白等的去乙酰化。除了细胞蛋白外,我们还发现了 HDAC6能够介导流感病毒蛋白PA的去乙酰化,影响其蛋白稳定性,抑制病毒基因的转录和复制。本研究我们通过mini-genome试验发现过表达HDAC6能够抑制流感病毒RNA聚合酶的活性,而其活性区域缺陷突变体HDAC6-DM则对聚合酶的活性没有影响,处理HDAC6抑制剂则发现RNA聚合酶活性升高。免疫印迹试验也表明HDAC6过表达能下调流感病毒的感染,而HDAC6-DM则对病毒没有影响。综上所述,HDAC6对于流感病毒RNA聚合酶活性的抑制依赖于其去乙酰化酶活性。