毛白杨再生体系建立和rolB基因遗传转化技术

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为解决毛白杨插条生根难的问题,本文通过组织培养实验,在毛白杨离体培养再生技术体系建立的基础上,采用农杆菌介导法,将对植物生根起促进作用的rolB基因导入毛白杨。主要研究内容及结果如下: 1.对带有3-6片叶的根萌芽外植体在75%酒精浸泡30s后,用1%“84”消毒液进行5min体表灭菌处理,得无菌苗且成活率可达100%。毛白杨根萌芽适合启动培养基为:MS+6-BA(0.5mg/L)+NAA(0.1mg/L)+白砂糖3%+琼脂0.52%,pH值6.0:适宜的继代培养基为:MS+6-BA(0.3mg/L)+NAA(0.1mg/L)+白砂糖3%+琼脂0.52%,pH值6.0;适宜的生根培养基为:MS+白砂糖3%+琼脂0.52%,pH值6.0。 2.适合毛白杨叶片不定芽分化培养基为:MS+6-BA(2.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)+白砂糖3%+琼脂0.52%,pH值6.0;MS基本培养基添加6-BA和NAA的比例在2-5:1之间时,可以诱导大量不定根的形成。不同无性系再生频率差别很大,本实验中G2和G3的再生频率高;暗培养2d时对叶片分化不定芽的再生频率略有提高;与培养皿培养相比较,三角瓶培养不定芽再生率较高。 3.毛白杨对不同抗生素的敏感性不同,通过抗生索敏感性试验,确立了叶片外植体不定芽诱导、茎段增殖和生根Kan的临界耐受浓度分别为30mg/L和50mg/L。毛白杨叶片对Cef的敏感性较差,结合Cef对农杆菌的抑菌效果,在遗传转化和再生、扩繁、生根时都选择200-400mg/L浓度加入为宜。 4.通过对影响农杆菌转化效率的几个主要因素的研究,得出适合毛白杨遗传转化的方法和步骤。选择2d的预培养时间,用OD600=0.4浓度的菌液侵染10min,添加乙酰丁香酮,2d的推迟筛选都可以提高转化频率。 5.转化植株在含抗生素培养基上的筛选和再生分化不定芽成功,以及PCR检测初步显示外源基因已经整合到毛白杨基因组中。最后将组培苗和经过遗传转化的毛白杨试管苗移栽成活。
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