立题依据：肿瘤转移是导致肿瘤患者最终死亡的首要原因,其过程主要包括肿瘤细胞从原发部位的脱离、肿瘤细胞随血液运行以及肿瘤细胞在转移部位的种植。目前,已有较多的研究发现,血小板在肿瘤细胞转移过程中发挥着举足轻重的作用。血小板参与肿瘤转移的具体机制尚未完全清楚,其中一种重要的可能机制便是进入血液中的肿瘤细胞激活血小板,使血小板形成类似于“斗篷”的瘤栓将肿瘤细胞包裹从而使肿瘤细胞逃逸免疫系统的杀伤。清除循环血液中的肿瘤细胞大部分是要靠NK细胞来实现,因此肿瘤细胞活化血小板是导致其逃逸NK细胞免疫监视的最主要的原因。肿瘤活化其包被在表面的血小板并刺激血小板释放一些可溶性的活性因子,抑制了NK细胞的杀伤作用及生成干扰素(IFN—γ)勺能力。血小板衍生的活性成分中,TGF-β通过下调NK细胞表面免疫活性受体(NKG2D)的活性达到抑制NK细胞活性的目的。中医理论认为,肿瘤的产生与瘀血关系密切。现代医学角度分析表明,活血中药在改变血液流变学和凝固性,降低血液粘度,消除徽循环障碍方面有一定优势。已有研究证实,隐丹参酮对肿瘤细胞有细胞毒作用,在阻碍细胞增殖和诱导细胞凋亡方面起到一定作用,同时有报道称认为隐丹参酮具有抗血小板聚集等活性。进一步研究隐丹参酮对肿瘤细胞基于血小板活化而逃逸NK细胞免疫监视的干预作用,将为活血化瘀法从免疫相关角度预防肿瘤血行转移提供实验依据。研究方法：通过对健康BALB/c雌小鼠眼球取血,离心分离血小板,通过流式分选技术,分离BALB/c小鼠脾脏中的NK细胞。获得二者之后,与4T1肿瘤细胞一起,建立4T1肿瘤细胞、血小板、NK细胞共培养体系,在此过程中显微镜下观察血小板与肿瘤细胞的黏附并拍摄图像；在用隐丹参酮干预之前,首先用MTT法检测隐丹参酮对4T1肿瘤细胞的自然生长的影响并绘制生长曲线,计算获得IC50浓度时,用其来进行下一步实验。建立不同的共培养模型同时用药干预并分组,包括：单独4T1肿瘤细胞组(1组),隐丹参酮干预4T1肿瘤细胞组(2组),4T1肿瘤细胞与血小板混合组(3组),隐丹参酮干预4T1肿瘤细胞与血小板混合组(4组),4T1肿瘤细胞、血小板、NK细胞混合组(5组),隐丹参酮干预4T1肿瘤细胞、血小板、NK细胞混合组(6组)。培养24小时之后,通过ELISA方法检测细胞上清液中TGF-β、IFN-γ的含量。研究结果：MTT实验发现,隐丹参酮对于4T1肿瘤细胞增殖的抑制作用明显,IC50为16.7μmol;通过血小板提取以及与4T1肿瘤细胞混合培养观察黏附发现,肿瘤细胞确实能激活血小板,并使血小板黏附于其周围,形成球形包裹,但是,观察也发现加入隐丹参酮组和未加隐丹参酮组的黏附状态和数量未有明显不同；同时还发现,肿瘤细胞周围额外包裹一层透明膜样物质。通过流式分选获得较高纯度的NK细胞,ELISA方法检测细胞上清液中TGF-β、IFN-γ发现,单独4T1组的TGF-β均值为791.13pg/ml,而加入隐丹参酮之后的4T1组TGF-β均值为551.67pg/ml,两者差异明显；4T1与血小板混合培养后TGF-β均值为2350.04pg/ml,与单独单独4T1组差异十分明显,加入隐丹参酮的4T1与血小板组TGr-β均值为2120.977pg/ml,与未加药组无明显差异;4T1与血小板和NK细胞共培养组TGF-β均值为2367.56pg/ml,加入隐丹参酮后,均值为2530.38pg/ml,两组结果无明显差异。IFN-γ检测结果为各组数据均无统计学意义。结论：混合培养表明,血小板确实能与4T1肿瘤细胞黏附,将其包裹,为支持假说肿瘤细胞激活血小板逃逸NK细胞的免疫监视提供了依据；隐丹参酮在抑制4T1肿瘤细胞增殖方面作用明显,但从黏附图像和Flisa结果来看,它抑制血小板聚集和抑制血小板分泌TGF-β的能力都不明显；血小板确实能够分泌大量的TGF-β,而TGF-β能够抑制NK细胞的杀伤活性,该实验从细胞因子角度支持了这一结论,但是NK细胞分泌IFN-γ功能未能捡出。通过该实验说明,血小板在帮助肿瘤细胞逃逸NK细胞的免疫监视方面确实发挥了重要作用,无论从图像上还是从细胞因子角度都支持这一观点,但是,隐丹参酮抑制肿瘤细胞增殖能力明显而活血作用不太明显,下一步实验可以考虑换更有效的活血药物。