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肠黏液屏障是存在于肠上皮腔表面的重要生理屏障,对于保护肠黏膜免受肠内有害物质侵扰具有重要作用,多种肠道疾病发病机制涉及肠黏膜屏障功能障碍,但影响肠黏膜屏障的因素众多,其具体调节机制目前仍未充分阐明。Piezo1蛋白是最近发现的第一个真正意义上的机械敏感离子通道,可以直接感受机械刺激,开放非选择性阳离子通道,将感受的机械信号转化为生物电信号,在细胞功能如形态、增殖、分化、分泌等的调控中发挥重要作用。肠上皮细胞中表达有丰富的Piezo1,同时肠道微环境中也存在着张应力、剪应力和肠腔内压力等多种机械信号,这些信号是否能够被Piezo1感知,进而影响肠黏液屏障目前尚无研究。第1部分:Piezo1表达水平影响LS174T细胞黏蛋白生成目的:探索Piezo1表达水平是否与LS174T细胞黏蛋白生成有关方法:用免疫荧光方法明确Piezo1蛋白在LS174T细胞中的表达。分别采用慢病毒包装Piezo1基因shRNA感染LS174T细胞以下调Piezo1表达和慢病毒包装Piezo1基因的sgRNA两步法感染LS174T细胞以上调Piezo1的表达。对病毒感染后的细胞,采用ELISA方法检测mucin2,mucin5AC蛋白水平的变化,采用RT-PCR方法检测mucin2,mucin5AC mRNA水平的变化结果:Piezo1蛋白在LS174T细胞中表达丰富。慢病毒感染显著下调LS174T细胞Piezo1表达后,mucin2,mucin5AC的mRNA水平降至正常组50%以下(p<0.05,p<0.05);相应蛋白水平也显著下降(p<0.05,p<0.05)。慢病毒感染上调LS174T细胞Piezo1表达后,mucin2,mucin5AC蛋白水平显著上升(p<0.05,p<0.05),mRNA水平有上升趋势,但趋势不明显。结论:干预LS174T细胞中Piezo1表达明显影响其mucin2,mucin5AC的生成。第2部分:Piezo1通道活化状态影响LS174T细胞黏蛋白表达目的:探究Piezo1通道的活化状态对LS174T细胞黏蛋白表达的影响方法:采用Piezo1通道特异性的激动剂Yoda1和特异性的抑制剂GsMTx4干预LS174T细胞。用RT-PCR的方法检测mucin2,mucin5AC mRNA水平的变化。用ELISA的方法检测mucin2,mucin5AC蛋白水平的变化。结果:Yoda1激动活化Piezo1通道后,LS174T细胞mucin2,mucin5AC的mRNA及蛋白水平显著上升(p<0.01,p<0.01)。GsMTx4抑制Piezo1通道开放后,LS174T细胞mucin2,mucin5AC的mRNA水平显著下降(p<0.01),蛋白水平下降不明显。结论:激活Piezo1通道明显影响LS174T细胞mucin2,mucin5AC表达。第3部分:Piezo1通道活化状态影响离体肠黏膜黏液分泌目的:探究Piezo1通道的活化状态对于肠黏膜黏液分泌的影响方法:从健康小鼠中分离出完整的结肠肠黏膜后,利用自制体外灌流维持装置及肠黏膜黏液层厚度检测装置检测小鼠结肠肠黏膜黏液层厚度。采用Piezo1通道特异性的激动剂Yoda1和抑制剂钌红(RuR)干预小鼠肠黏膜,观察黏膜表面黏液层厚度变化。结果:采用自制体外灌流维持装置及肠黏膜黏液层厚度检测装置可以有效检测小鼠结肠黏液层厚度,近端结肠黏液层厚度为222.3±65.6μm,远端结肠黏液层厚度为435.5±54.4μm,且黏液层在灌流维持条件下可自然增长。Yoda1干预小鼠结肠黏膜后,结肠黏膜黏液层厚度增长幅度明显上升(p<0.01);RuR干预条件下,结肠黏膜黏液层厚度无明显增长(p=0.291)。结论:Yoda1刺激Piezo1通道开放可促进小鼠结肠黏膜黏液分泌,RuR抑制Piezo1通道开放可减少小鼠结肠黏膜黏液分泌。第4部分:不同形式的机械刺激促进LS174T细胞黏蛋白表达目的:探讨不同形式机械刺激对LS174T黏蛋白表达的影响方法:采用Flexcell公司的细胞力学应用装置及配套培养板,对LS174T细胞予以频率及力度恒定的牵拉刺激;将接种在普通培养板上的LS174T细胞置于微型翘板摇床上培养,予以细胞剪切力刺激;用不同浓度的明胶铺板,形成底部硬度不同的培养板用于LS174T细胞培养,予以细胞应力刺激。采用RT-PCR和ELISA的方法检测上述三种不同形式机械刺激下LS174T细胞mucin2,mucin5AC的表达。结果:机械牵拉刺激可显著促进LS174T细胞mucin2,mucin5AC的表达;剪切力刺激可促进LS174T细胞mucin2,mucin5AC的表达,且与刺激时间相关;一定条件的应力刺激可下调LS174T细胞mucin2,mucin5AC的表达。结论:机械刺激对LS174T细胞mucin表达有显著影响,影响效应与机械刺激的形式和时间都有关联。第5部分:机械牵拉刺激对LS174T细胞黏蛋白的促进作用通过Piezo1介导目的:探讨Piezo1在机械牵拉刺激调节黏液分泌这一过程中的作用机制方法:采用Piezo1通道特异性的抑制剂GsMTx4干预机械牵拉刺激培养条件下的LS174T细胞,ELISA方法检测其对Mucin2,Mucin5AC表达的影响。用RT-PCR和Westernblot的方法检测机械牵拉刺激培养条件下,以及Piezo1激动剂、抑制剂干预条件下LS174T细胞内的Erk信号通路变化。采用Erk通路抑制剂PD98059干预机械牵拉刺激培养条件下以及Piezo1激动剂作用下的LS174T细胞,用RT-PCR和ELISA的方法检测mucin2,mucin5AC表达的变化。结果:Piezo1通道特异性抑制剂GsMTx4可显著抑制机械牵拉刺激对LS174T细胞Mucin2,Mucin5AC表达的促进作用。机械刺激培养条件下以及Piezo1激动剂作用下LS174T细胞磷酸化Erk表达明显上升,Piezo1抑制剂可下调机械刺激培养条件下磷酸化Erk的表达。Erk通路抑制剂可下调机械刺激作用下LS174T细胞mucin2,mucin5AC的表达,并降低Piezo1激动剂对LS174T细胞mucin表达的促进作用。结论:Piezo1可能是通过Erk通路介导了机械牵拉刺激对LS174T细胞mucin2,mucin5AC表达的促进作用。