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近年来极端高温天气频繁发生,严重影响农作物的生长发育。植物遭受高温胁迫时,诱导大量产生HSP70蛋白,其作为分子伴侣协助植物抵抗高温胁迫的影响。Micro RNA(mi RNA)是一类长度为21-24nt普遍存在于真核生物体内的内源性单链非编码小RNA,介导靶基因切割或抑制其翻译来调控生物体内的多种生命活动,如参与调控植物高温胁迫途径。本研究中novel-mi R311是利用高通量技术在甘蓝型油菜茎尖中发现的新mi RNA,其靶基因为HSP70家族基因。构建novel-mi R311超表达载体,转化拟南芥和甘蓝型油菜,通过对转基因植株高温胁迫后的表型鉴定和后续q PCR及可溶性糖含量分析结果,初步阐明了其生物学功能。主要结果如下。1.通过对novel-mi R311前体序列与甘蓝型油菜和拟南芥基因组序列比对,发现其存在于甘蓝型油菜Bna A06g01660D第一个内含子上,拟南芥中无其相似序列。甘蓝型油菜J572中克隆Bna A06g01660D,发现克隆的Bna A06g01660D中无novelmi R311前体序列。进而分别在白菜、甘蓝、芥菜型油菜和甘蓝型油菜的多个品种中克隆novel-mi R311前体和Bna A06g01660D,发现上述所有材料中都能克隆到novelmi R311前体,但只有白菜和甘蓝型油菜中双11中克隆的Bna A06g01660D中存在novel-mi R311前体,其它材料中具体位置还有待研究。同时novel-mi R311前体的最小折叠自由能符合mi RNA的特征,且其二级结构为稳定的发夹结构。2.对降解组测序预测的novel-mi R311的10个靶基因分析,其中8个属HSP70家族,另外2个属转导蛋白类基因。5’-RACE技术验证其中两个靶基因Bna Cnng03470D和Bna A10g27060D(HSC70-1),在甘蓝型油菜中被切割。拟南芥基因组中无novel-mi R311前体序列,因此为验证novel-mi R311在拟南芥体内是否对其靶基因切割,将预测的10个甘蓝型油菜靶基因与拟南芥基因组中的同源基因进行序列比对分析,发现油菜中的靶基因与拟南芥同源基因序列相似度非常高。3.为进一步阐明novel-mi R311是否通过介导其靶基因HSC70-1的剪切来实现其在植物非生物胁迫应答途径中的功能,构建novel-mi R311的超表达载体,转化拟南芥和甘蓝型油菜。4.拟南芥中的q PCR结果显示,novel-mi R311在转基因拟南芥中表达,而野生型中没有表达,其靶基因表达量在转基因拟南芥中显著下调。甘蓝型油菜中的q PCR结果表明,novel-mi R311在J572中整体表达量不高,但相对而言根和茎中表达量较高。5.高温胁迫实验结果显示,拟南芥和甘蓝型油菜中novel-mi R311转基因阳性苗高温胁迫后其生长势和存活率都显著低于相应的对照。q PCR结果显示,无论是热胁迫前还是热胁迫后,甘蓝型油菜阳性苗体内novel-mi R311表达量都显著高于对照J572,而其靶基因HSC70-1表达量显著低于对照J572;HSC70-1表达量在热胁迫后较热胁迫前升高。可溶性糖含量测定结果显示,无论是拟南芥还是甘蓝型油菜,其阳性苗在热胁迫后可溶性糖含量显著低于热胁迫前,而其对应的对照热胁迫后可溶性糖含量高于热胁迫前。