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目的:(1)建立高速逆流色谱(High-speedcounter-currentchromatography,HSCCC)与大孔树脂层析柱结合的方法,用于仙鹤草药效物质的分离纯化;(2)建立多指标成分定量以及指纹图谱分析法对仙鹤草进行质量控制研究。
方法:(1)首先将仙鹤草乙醇提取物进行大孔树脂柱层析分离,得到不同浓度的初分产物;然后采用HSCCC在优化分离条件下,对各初分产物再进行分离纯化,得到相应化合物;这些物质经过标准品对照、质谱(MS)、紫外(UV)和核磁共振(NMR)法进行结构鉴定,还要通过HPLC检测进行纯度分析。(2)在获取的药效物质基础上,采用HPLC法进行多指标成分测定和指纹图谱分析,对16个批次的仙鹤草药材进行质量控制研究。
结果:(1)采用D101大孔树脂对500g仙鹤草药材的粗提物进行初步分离,得到20%、40%、50%和60%乙醇洗脱液,蒸干后分别得到相应的初产物1(8.0g)、2(13.3g)、3(3.6g)和4(5.3g)。初产物1采用乙酸乙酯-正丁醇-水(1∶4∶5,v/v)溶剂系统经HSCCC分离得到化合物花旗松素3-O-葡萄糖苷(6.4mg,纯度:94.24%);初产物2采用乙酸乙酯-水(1∶1,v/v)溶剂系统经HSCCC分离得到槲皮苷(13.0mg,纯度:95.37%);初产物3采用正已烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶5∶1∶5,v/v)溶剂系统经HSCCC分离得到银椴苷(14.7mg,纯度:97.42%)和仙鹤草内酯(21.4mg,纯度:95.29%);初产物4采用乙酸乙酯-正丁醇-水(1∶4∶5,v/v)溶剂系统经HSCCC分离得到委陵菜酸(29.8mg,纯度:96.34%)。(2)建立了一种可以有效控制仙鹤草质量的HPLC法,并采用此方法对16个批次的仙鹤草中芦丁、槲皮苷、木犀草苷、银椴苷、芹菜素、山柰酚和仙鹤草内酯等7种成分的含量进行了测定。并且对这些产地的仙鹤草进行了指纹图谱分析,根据指纹图谱中的11共有峰的相对峰面积对16个批次的仙鹤草药材进行了相似度评价和层序聚类分析。
结论:(1)本实验采用HSCCC对仙鹤草进行有效物质的分离,首次同时从仙鹤草中分离得到花旗松素3-O-葡萄糖苷、槲皮苷、银椴苷、仙鹤草内酯和委陵菜酸5种高纯度单体化合物。建立了对仙鹤草中生物活性成份分离纯化的有效方法,并且进一步证明了HSCCC是一种药用植物中天然化合物分离的有效技术。(2)基于得到的物质基础,首次通过反相HPLC对16个批次仙鹤草中7种有效成份进行定量分析。同时结合仙鹤草的指纹图谱对不同产地的仙鹤草进行了了相似度的评价和聚类分析。本实验建立的HPLC分析方法简单、可靠,具有良好的线性、精密度、准确度、重复性和稳定性,能够准确对仙鹤草药材的质量进行全面控制。