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目的:Roux-en-Y胃旁路术是当前临床上减重代谢主流术式之一,对体重及血糖控制效果良好而持久,但其作用机制尚无统一结论。研究表明,肠道内革兰氏阴性菌产生脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)透过肠道黏膜屏障促使全身低度炎症反应综合征,导致肥胖、糖尿病、高脂血症、高血压等代谢性疾病。本研究通过建立肥胖糖尿病大鼠Roux-en-Y胃旁路术模型,观察胃旁路术后门静脉循环LPS及炎症指标变化及末端回肠黏膜机械屏障的改变,探讨胃旁路术可能的作用机制。方法:(1)肥胖糖尿病大鼠模型建立:6周龄Sprague Dawley(SD)大鼠50只,经高脂饲养12周,小剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)30mg/kg腹腔注射,随机血糖≥16.7mmol/L为糖尿病模型。(2)手术预实验:练习组20只大鼠完成Roux-en-Y胃旁路术学习,观察麻醉方式、手术时间、术中出血、围术期补液及喂养方式对大鼠存活的影响,绘制手术学习曲线,归纳总结建模经验。(3)实验分组:随机将建模大鼠分为手术组(Bypass组;n=10)、假手术组(Sham组;n=10)、高脂对照组(HFD组;n=5)。Bypass组行胃旁路术,假手术组行剖腹探查及胃、肠壁切开缝合,其手术时间与手术组相同,术后均采用普通饲料喂养,HFD组采用高脂饲料持续喂养。设置正常对照组(Normal组;n=5),予普通饲料持续喂养。测量各时间段大鼠体重、空腹血糖确立基线水平。(4)实验一般观察项目:术前测量大鼠体重、空腹血糖基线水平,术后每周测量2次空腹血糖及体重,绘制曲线并行统计学分析。(5)门静脉血清指标及肝脏组织学检测:术中及术后12周采用1%戊巴比妥腹腔麻醉,开腹后于肝十二指肠韧带细空针抽取各组大鼠空腹门静脉血1.5ml,采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定LPS、脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)、超敏C反应蛋白(high sensitive C reaction protein,hs-CRP)浓度,评价胃旁路术对肥胖糖尿病大鼠门静脉内毒素血症的影响。处死大鼠前取肝脏组织,HE染色评价肝脏脂肪变性改善情况。(6)大鼠末端回肠黏膜组织学检测:免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色观察末端回肠黏膜Occludin、Claudin-1分布。蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测肠组织中Occludin、Claudin-1蛋白表达水平。荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)检测肠组织中Occludin、Claudin-1蛋白mRNA相对含量。透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)观察肠上皮细胞间紧密连接完整性及细胞器形态,观察胃旁路术对肠道黏膜上皮结构及机械屏障的影响。结果:(1)高脂饲养组50只饲养12周,体重(651.9±33.0)g;普通饲料对照组平均体重(500±52.0)g,实验组体重超过对照组30.4%,差异具有统计学意义(P<0.001)。经禁饮禁食12小时,STZ 30mg/kg腹腔注射,其中4只大鼠给予二次腹腔注射STZ 20mg/kg,成功建立47只肥胖糖尿病大鼠模型,肥胖糖尿病大鼠建模成功率为94%。(2)练习组20只完成手术练习及护理模式探索,存活率35%。影响存活主要因素为:麻醉意外(3例)、术中出血(2例)、术后循环衰竭(6例)、吻合口漏(2例),总体并发症发生率60%。建模主要难度在术中失血预防及术后护理,通过练习缩短手术时间,减少麻醉用量,并对术后护理不断改进,采用持续饮水供给、早期流质饮食及限制性固体摄入,能增加大鼠存活率。实验阶段,整体存活率达90%。(3)各组间术前体重、空腹血糖对比无统计学差异(P>0.05)。Bypass组及假手术组术后体重均出现下降趋势,2周后假手术组体重缓慢增加,与高脂饲料对照组保持一致。Bypass组术后1周血糖水平出现明显下降趋势,术后第4周基本恢复正常,并表现出持久、稳定的血糖水平。而假手术组和高脂对照组血糖维持在较高水平。与假手术组相比,术后2周开始,Bypass组血糖及体重变化差异具有统计学意义(P<0.01)。(4)肥胖糖尿病大鼠较正常对照大鼠术前门静脉LPS[(1.23±0.46)vs(0.40±0.11)]EU/ml、LBP[(39.48±5.69)vs(19.89±3.27)]ng/ml、hs-CRP[(5.11±1.29)vs(1.81±0.49)]ng/ml,浓度均明显增高,差异均具有统计学意义(P<0.001)。术后1 2周,B y p a s s组与假手术组相比L B P[(2 5.7 1±3.5 6)v s(37.03±1.69)]ng/ml,差异有统计学意义(P<0.001);hs-CRP[(2.60±0.53)vs(3.49±1.28)]ng/ml、LPS[(0.57±0.12)vs(0.64±0.21)]EU/ml,浓度均较假手术组下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。Bypass组及假手术组术后各项炎症指标与高脂对照组均有不同程度下降,但与普通饲料对照组间对比,假手术组仍明显升高(P<0.05)。Bypass组与高脂对照组比较,LPS[(0.57±0.12)vs(1.24±0.25)]EU/ml、LBP[(25.72±3.56)vs(41.24±7.14)]ng/ml、hs-CRP[(2.59±0.53)vs(5.87±1.01)]ng/ml浓度降低,差异均有统计学意义(P<0.001)。(5)高脂诱导的肥胖大鼠肝脏存在较为严重的脂肪肝,HE染色后观察高脂对照组,可见大量肝细胞空泡变性,变性肝细胞明显肿胀变形,胞质溶解或消失,呈网状或几乎透明,肝细胞脂肪变性,可见胞质内含数量不等、大小不一、边缘整齐的圆形脂滴。Bypass组及假手术组术后肝脏组织镜下形态,均较高脂对照组明显缓解,其中Bypass组脂肪肝缓解率最高,假手术组术后采用长期普通饲料喂养,脂肪肝亦有较明显改善。(6)通过IHC、WB检测末端回肠黏膜Occludin、Claudin-1蛋白的表达水平,qPCR检测Occludin、Claudin-1 mRNA的相对含量,Occludin、Claudin-1表达水平在高脂对照组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),但Bypass组及假手术组术后均与正常对照组无明显差异(P>0.05)。透射电镜观察末端回肠黏膜上皮,各组大鼠均观察到紧密连接结构存在,高脂对照组及假手术组存在明显线粒体空泡化,高脂对照组更为严重,而Bypass组与正常对照组未观察到此改变,提示肥胖糖尿病大鼠肠黏膜上皮线粒体功能受损。结论:(1)高脂饮食饲养联合小剂量STZ构建肥胖糖尿病大鼠模型的方法可靠,建模成功率高。(2)Roux-en-Y胃旁路术对肥胖糖尿病SD大鼠代谢性炎症有明显改善作用,可以治疗肥胖、糖尿病、脂肪肝等代谢性疾病。(3)肥胖糖尿病大鼠肠黏膜上皮线粒体功能受损,Roux-en-Y胃旁路术可能通过对黏膜上皮能量代谢的影响改善小肠黏膜上皮屏障功能,降低循环中的LPS水平。