1目的:探讨阳和汤大鼠含药血清对人肺癌GLC-82细胞作用及其作用机制,为临床应用阳和汤治疗肺癌提供理论依据。同时也为中医温阳法抗癌提供理论依据。方法:本研究分为生理盐水对照组、阳和汤组(姜炭2g、鹿角胶9g、肉桂3g、熟地30g、白芥子6g、生甘草3g、麻黄2g)、阳和汤热药组(姜炭2g、鹿角胶9g、肉桂3g)、阳和汤非热药组(白芥子6g、生甘草3g、麻黄2g、熟地30g),三个中药组以低、中、高剂量各分为三组,共10组。用低、中、高剂量的阳和汤、阳和汤热药、阳和汤非热药水煎剂分别给SD大鼠灌胃,制备低、中、高剂量阳和汤、热药、非热药含药血清;并用相同的方法同时制备生理盐水对照血清。以上述血清分别作用于人肺腺癌GLC-82细胞:采用MTT法观察阳和汤含药血清、热药含药血清、非热药含药血清在24h、48h、72h对GLC-82细胞生长的抑制作用,流式细胞术检测上述含药血清在48h时对GLC-82细胞周期的变化和凋亡的影响。光镜下观察上述血清作用前后GLC-82细胞的形态学变化。应用细胞免疫化学法检测上述血清作用于GLC-82细胞后凋亡相关蛋白bcl-2的表达情况。结果:1阳和汤高剂量血清组的吸光度值在48h和72h时低于对照组血清,并且有显著统计学意义(P<0.01);同时可以看到其作用24h、48h、72h的生长抑制率分别为-1.1%、45.2%、74.6%,并且随着作用时间延长,其吸光度逐渐降低,抑制率逐渐增高。阳和汤热药高剂量血清组的吸光度值低于对照血清组,有显著统计学意义(P<0.01);同时可以看到阳和汤热药高剂量血清组24h、48h、72h时生长抑制率分别为-0.4%、36.4%、59.8%,并随着作用时间的延长,其吸光度值逐渐降低,抑制率逐渐增高。阳和汤非热药高剂量组的吸光度在72h时低于对照血清组,有显著统计学意义(P<0.01);同时可以看到其在24h、48h、72h生长抑制率分别为-1.8%、0.8%、9.3%,并且随着作用时间的延长,其吸光度并不逐渐降低,而抑制率逐渐增高。阳和汤高剂量血清组抑制率在48h、72h高于相对应的热药组高剂量血清组和非热药高剂量血清组,有显著统计学差异(P<0.01);高剂量热药血清组抑制率在48h、72h高于相对应的高剂量非热药血清组,并有统计学意义(P<0.01)。其他药物血清组与对照血清组的吸光度值之间没有统计学意义。2低、中、高剂量阳和汤血清组的S期细胞所占比例在作用48h时均低于对照血清组,有显著统计学意义(P<0.01);其中中、高剂量阳和汤血清组的G0/G1期所占比例均高于对照血清组,有显著统计学意义(P<0.01)。低、中、高剂量阳和汤热药血清组的S期细胞所占比例在作用48h时均低于对照血清组,有显著统计学意义(P<0.01),而三组的G0/G1期所占比例均高于对照血清组,有显著统计学意义(P<0.01)。阳和汤非热药高剂量血清组的S期细胞所占比例在作用48h时低于对照血清组,有显著统计学意义(P<0.01),同时低、中、高剂量阳和汤非热药血清组的G0/G1期所占比例均高于对照血清组,有显著统计学意义(P<0.01)。中剂量阳和汤组S期细胞所占比例低于中剂量热药组和中剂量非热药组,并且有显著统计学意义(P<0.01);中剂量阳和汤热药组S期细胞所占比例低于中剂量非热药组,并且有显著统计学意义(P<0.01);高剂量阳和汤组G0/G1期所占比例要高于高剂量热药组和高剂量非热药组,并有统计学意义(P<0.01)。提示阳和汤、阳和汤热药、阳和汤非热药均有阻滞细胞周期作用,但是差异不明显。3阳和汤中、高剂量血清的凋亡率在作用48h时分别为24.64%、28.76%,均高于对照血清组,有显著统计学意义(P<0.01);并且随着剂量的增高凋亡率逐渐增大,有统计学意义(P<0.05)。阳和汤热药中、高剂量血清的凋亡率在含药血清作用48h时分别为18.57%、23.6%,均高于对照血清组,有显著统计学意义(P<0.01);并且随着剂量的增高凋亡率逐渐增大,有统计学意义(P<0.05)。其它中药血清组与对照血清组之间的凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。阳和汤中、高剂量血清组的凋亡率高于相对应的阳和汤热药中、高剂量血清组和阳和汤非热药中、高剂量血清组,有统计学意义(P<0.05)。阳和汤热药中、高剂量血清组的凋亡率高于相对应的阳和汤非热药中、高剂量血清组,有显著统计学意义(P<0.01)。4倒置显微镜观察,可见高剂量阳和汤、高剂量阳和汤热药含药血清处理后,GLC-82细胞变小、变圆,悬浮于培养液中,胞浆透亮度下降,核颜色加深,折光性增强;HE染色光镜观察,可见以上含药血清处理后,GLC-82细胞体积缩小,变圆,胞膜皱缩,胞核内染色质密度增高,呈半月形凝集在核膜周边,显示典型的凋亡细胞特点。其他血清组变化不明显。5免疫细胞化学法检测结果显示,对照血清组和阳和汤非热药组的凋亡相关蛋白blc-2的表达呈强阳性。低、中、高剂量阳和汤组的含药血清组凋亡相关蛋白blc-2表达降低,均呈阴性。低、中、高剂量阳和汤非热药组的含药血清组凋亡相关蛋白blc-2表达也降低,呈弱阳性,但是其凋亡相关蛋白blc-2表达高于相对应的低、中、高阳和汤组的含药血清组。结论:本研究显示:1阳和汤可明显抑制GLC-82细胞的增殖,可阻滞细胞周期于G0/G1期,减弱bcl-2的表达,诱导细胞凋亡,并存在一定的剂量-时间依赖性。提示阳和汤具有一定的抗肺癌作用,可能通过阻滞细胞周期和诱导凋亡发挥抗癌作用。2阳和汤热药可明显抑制GLC-82细胞的增殖,可阻滞细胞周期于G0/G1期,减弱bcl-2的表达,诱导细胞凋亡,并存在一定的剂量-时间依赖性。提示阳和汤热药具有一定的抗肺癌作用,可能通过阻滞细胞周期和诱导凋亡发挥抗癌作用。3高剂量的阳和汤非热药具有一定的抗肺癌作用,可以阻滞细胞周期于G0/G1期,诱导细胞凋亡,但是机制不明。4本实验提示:阳和汤在抑瘤率、阻滞细胞周期于G0/G1期、凋亡率、抑制抗凋亡蛋白bcl-2表达等方面作用较阳和汤热药和阳和汤非热药明显,而阳和汤热药在这些方面的作用较阳和汤非热药明显。说明阳和汤整方的抗肿瘤作用高于阳和汤热药和阳和汤非热药。阳和汤热药可能在阳和汤整方抗肿瘤作用中起主导作用。阳和汤非热药起着相同或者协同作用。初步证实中医温热药具有抗癌作用,支持癌症属阴寒的观点。